keerpunten in de natuurwetenschappen

1. keerpuntenin de natuurwetenschappen hoe ontdekken we hoe Leven werkt...? roel van driel Swammerdam Inst. voor Levenswetenschappen Universiteit van Amsterdam

2. big bang elementaire deeltjes sterrenstelsels is dit iets anders…? zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie

3. big bang hoe gaan we begrijpen hoe het werkt…? elementaire deeltjes sterrenstelsels zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie

4. de levende cel

5. de levende cel

6. de levende cel

7. genetische informatie:de basis DNA • een gen bevat de informatie voor de aminozuur-volgorde van een eiwit • aminozuurvolgorde bepaalt de opvouwing van het eiwit • opvouwing van het eiwit bepaalt de functie • dus: een gen codeert voor een functie in de cel eiwit functie in de cel

8. de DNA taal • genetische code is simpele taal met slechts vier letters • A, T, G, C

9. eiwitten kunnen bijna alles • elk gen bevat de informatie voor één bepaald eiwit

10. wat maakt eiwitten zo bijzonder • elk eiwit is lange onvertakte keten van aminozuren • 20 verschillende aminozuren • heel breed scala van functies • specificiteit • heel precies herkennen, binden en chemisch veranderen van andere moleculen

11. eiwitten en genen werken samen in netwerken • netwerken van samenwerkende componenten in de cel • eiwitten en enzymen • genen • speciale systeem- eigenschappen geselecteerd tijdens evolutie • robuustheid • efficientie • aanpassen aan omgeving • ‘leven’ is een netwerk van chemische en fysische netwerken

12. eiwitten en genen: samenspel is alles...! DNA • genen in DNA coderen voor eiwitten • eiwitten bepalen de eigenschappen van de cel • eiwitten zetten genen aan en uit • die genen coderen weer voor weer voor eiwitten • die eiwitten geven weer nieuwe eigenschappen aan een cel • eiwitten zetten genen aan en uit eiwit functie in de cel

13. de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag • kijken naar moleculen in de levende cel • gentherapie • DNA chip technologie • PCR en toepassingen

14. zichtbaar maken van eiwitten in de levende cel met de hulp van een kwal...green fluorescent protein (GFP) - GFP is een eiwit met ~225 aminozuren van de kwalAequorea victoria - gen dat codeert voor GFP is gecloneerd

15. GFP fusie-eiwittenextreem handig • koppel eiwit waarin je geinteresseerd bent aan GFP eiwit • je eiwit wordt dan lichtgevend • danzichtbaar in microscoop

16. + gen voor GFP eiwit gen voor histon eiwit gen voor GFP-histon fusie eiwit GFP-fusie eiwit • uitvoerbaar voor elk eiwit

17. bijvoorbeeld: zichtbaar maken van het menselijk genoom in de levende cel • DNA verpakkings-eiwit koppelen aan GFP • GFP-histon H2B • gen dat codeert voor dit eiwit in cel brengen • cel maakt het juiste GFP-gekoppelde eiwit

18. GFP is een fluorescerend eiwit:zichtbaar maken in een fluorescentie-microscoop • preparaat bestralen in microscoop met blauw licht • GFP absorbeert blauw licht • GFP zendt groen licht uit

19. fluorescentie microscopie voor 3-dimensionale beelden microscoop

20. menselijk genoom in levende cel zichtbaar gemaakt

21. een andere toepassing van GFP fusie eiwitten hoe overleef ik mijn zonnebank, of een dagje aan het strand…?

22. zonlicht bevat UV • DNA schade na een uurtje in de zon of op de zonnebank door UV licht • vele duizenden DNA beschadigingen in elke huidcel...! • toch maar kleine kans op bijv. kanker • we hebben heel efficiënte systemen om DNA schade te repareren

23. ultraviolet licht induceert chemische reacties in DNA UV licht cyclobutane pyrimidine dimer DNA beschadiging geeft mutaties stukje onbeschadigd DNA pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct

24. mutaties • mutatie is verandering van nucleotiden-volgorde in DNA • resulteert in andere aminozuurvolgorde van eiwit waarvoor gen codeert • meestal verlies van functie van eiwit • meestal verlies van eigenschap van cel • mutaties kunnen ziekten veroorzaken • bijvoorbeeld kanker X X X

25. DNA reparatie systeem • verschillende DNA reparatie-eiwitten binden aan beschadigd DNA • samen repareren ze de DNA schade • onderzoek hoe dit werkt in de levende cel • laat cel GFP-repair fusie-eiwitten maken

26. onderzoek naar hoe DNA reparatie werkt • maak één van de reparatie eiwitten fluorescent mbv GFP • zichtbaar mbv microscoop in celkern • celkern lokaal bestralen met UV licht • in rode cirkel • lichtgevende reparatie-eiwit bindt aan het beschadigde DNA • hopen zich op in beschadigd gebied

27. een zonnebank voor cellen in een microscoop masker met kleine gaatjes (1/200 mm) glaasje met levende cellen cel met lokale DNA schade

28. masker met heel kleine gaatjes in de microscoop masker gaatjes van 5 micrometer (1/200 millimeter)

29. masker bovenop laagje levende cellen masker

30. filter bovenop laagje levende cellen fluorescerende GFP-reparatie eiwit in cel masker

31. precies meten hoe het reparatie- eiwit aan beschadigd DNA bindt

32. XPB-EGFP accumulation at UV damage 25 20 15 % accumulation in spot 37 C 10 27 C 5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 -5 Time (sec) zelfde metingen voor verschillende reparatie eiwitten

33. resultaten samenbrengen in een computermodel computer modellen experimenten

34. de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag • kijken naar moleculen in de levende cel • gentherapie • DNA chip technologie • PCR en toepassingen

35. gentherapie made simpel DNA • gen  eiwit  functie • mutatie  defect gen  defect eiwit  verlies functie • concept van gentherapie is simpel • DNA in cel brengen met goed-functionerend gen • defect gerepareerd...! eiwit functie in de cel

36. boodschappenlijst gentherapie • gen vinden bij specifieke ziekte • kloneren van dat gen • geschikte vector om gen in de cel te brengen • target cellen identificeren • target cellen bereiken met vector • ingebrachte gen stabiel in cel integreren • ingebrachte gen stabiel tot expressie brengen

37. problemen en denkbare oplossingen…? • hoe breng je het gen in de juiste cel…? • selectief of alle cellen die bereikt worden...? • genetisch veranderen buiten het lichaam...? • haal te veranderen cellen uit het lichaam en breng nieuw gen in • plaats de veranderde cellen terug in lichaam • gebruik van stamcellen...? • genetisch veranderen en dan terugplaatsen in lichaam • bijv. stamcellen in beenmerg voor alle bloedcellen

38. waar richt gentherapie zich op clinical trials kanker-therapie is favoriet

39. het succesverhaal van SCID • ADA gentherapie • defect gen voor enzym adenosine deaminase (ADA) • severe combined immune deficiency (SCID) syndroom • eerste klinische testen in 1990 • ander SCID syndroom (SCID-X1) • succesvolle gentherapie sinds 2000 • 17 van 18 SCID patiënten na gentherapie goede expressie van ingebracht gen • zeer succesvol • maar...!

40. gentherapie voor SCID • bloed-stamcellen isoleren uit beenmerg • buiten het lichaam het gen inbrengen • overgebleven beenmergcellen in lichaam doden • genetisch veranderde cellen in bloedbaan • nestelen zich in beenmerg • produceren genetisch veranderde bloedcellen

41. wat genetisch mis kan gaan bij gentherapie • 2002: gentherapie veroorzaakt leukemie in twee patiënten • SCID-X1 gentherapie bij 3 jonge kinderen • na 3 jaar krijgen 2 kinderen leukemie • door toeval(??) insertie van ingebrachte gen in een oncogen • totale verrassing • FDA verbiedt SCID-X1 gentherapie tenzij er geen enkele andere optie is • moeilijke keuzes, etisch probleem X X

42. problemen en oplossingen…? ? • meeste virussen integreren hun DNA in genrijke gebieden in genoom • risico...! • sturen van transgen in DNA • maar hoe...? • denkbaar alternatief • ingebrachte gen niet laten integreren in DNA van cel • DNA van sommige virussen blijft als los stukje DNA in de celkern (episoom) • repliceert gelijktijdig met cel DNA tijdens celdeling X X

43. hoe wordt het DNAin de cel gebracht...? meestal m.b.v. virus

44. virussen vaak gebruikt om DNA binnen te brengen bij gentherapie Thomas et al., 2003

45. veel succesvol genetisch veranderde cellen in lever m.b.v. adenovirus heel veel cellen van afweersysteem infiltreren lever leverweefsel gentherapie met adenovirus is efficient maar sterke afweerreacties

46. wat immunologisch mis kan gaan bij gentherapie • 1999: adenovirus vector veroorzaakt dood van patiënt • vrijwilliger Jesse Gelsinger, 18 jaar, Philadelphia • leed aan milde vorm ornithine decarboxylase deficientie • productie van giftig NH3 • hyper immuunreactie op ingespoten adenovirus (zeldzaam...!!) • na 4 dagen overleden • injectie van grote hoeveelheid (inactieve) virusdeeltjes nu onveilig geacht door FDA

47. toekomst van gentherapie 2004 • onderzoek gaat onvermoeibaar verder...!

48. de wondere wereld van het biologisch onderzoekmenu van vandaag • kijken naar moleculen in de levende cel • gentherapie • DNA chip technologie • PCR en toepassingen

49. een droom-experiment • in één enkel experiment bij een cel vaststellen welke genen wel en welke genen niet aan staan • mens: 35.000 genen • het is mogelijk...! • DNA micro-arrays • DNA chips

50. RNA van gen 1 RNA van gen 2 RNA van gen 3 hoe meet je de activiteit van een gen...? • alleen genen die aan staan produceren RNA • hoe meer RNA hoe groter de aktiviteit van een gen