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IQB201 – Bioquímica Básica I

IQB201 – Bioquímica Básica I. Sequenciamento de Proteínas. Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ. Sequenciamento de Proteínas.

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IQB201 – Bioquímica Básica I

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Presentation Transcript

  1. IQB201 – Bioquímica Básica I Sequenciamento de Proteínas Joab Trajano Silva Instituto de Química/UFRJ

  2. Sequenciamento de Proteínas A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica, ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.

  3. Preparo da Proteína para o Sequenciamento • Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína • Clivar as pontes de enxofre (se houver) • Purificar cada uma das subunidades • Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade • Determinar o resíduo N-terminal

  4. I. Redução das Pontes Dissulfeto

  5. II. Composição de Aminoácidos da Proteína

  6. II. Composição de Aminoácidos da Proteína

  7. Completa destruição de Trp • Perda parcial de Ser, Thr e Tyr • Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn

  8. Hidrólise Alcalina • A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h • Decomposição de Cys, Ser e Thr • Desaminação e racemização de outros aminoácidos • Permite a quantificação de Trp

  9. Determinação do Resíduo N-terminal

  10. Análise do N-terminal (Edman)

  11. C-terminal Análise por Carboxipeptidase

  12. Separação dos aminoácidos por HPLC

  13. Leucina aminopeptidase: Análise do N-terminal

  14. Separação dos Aminoácidos Liberados

  15. Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica • Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados diretamente • Purificar cada fragmento • Determinar a sequencia de aminoácidos de cada fragmento purificado • Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso de outro método de clivagem

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