MSc . Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA FACULDADE DE MEDICINA LABORATÓRIO DE ONCOLOGIA EXPERIMENTAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA INDUCTION OF G2/M ARREST BY FR42 ISOLATED FROM MitracarpusBaturitensis Sucre (RUBIACEAE) IN SF-295 CELLS. MSc. Igor da Silva Bomfim Orientadora: Prof. Drª Cláudia do Ó Pessoa Fortaleza/CE 2014

2. História • Esqueletos de pessoas antiga Grécia, Egito e Chile – tumores malignos; • Diagnóstico câncer retal em uma múmia egípcia (DAVID & ZIMMERMAN, 2010) • Câncer (Grego - caranguejo) • Hipócrates – Grécia Antiga • Conjunto de doenças • Crescimento desordenado • Poder invasivo http://www.thedailygreen.com http://www.ciclodavida.com.br (BROWN & ATTARDI, 2005)

3. Câncer • 2ª causa de morte no mundo → Problema de saúde pública • Em 2008: 7,6 milhões de mortes (13 % do total) no mundo 70 % ocorreram em países de baixa ou média renda • Até 2020: Cerca de 15 milhões de novos casos 60 % em países em desenvolvimento Brasil – 518.510 novos casos (estimativa do INCA para 2012 e 2013) Fonte: OMS 2008

4. Brasil Fonte: INCA 2011

5. Câncer “ Doença complexa caracterizada pela instabilidade genética de células que tem a capacidade de se multiplicar descontroladamente.” ATIVAÇÃO DE ONCOGENES PROGRAMAS CELULARES: PROLIFERAÇÃO MIGRAÇÃO DIFERENCIAÇÃO APOPTOSE ALTERAÇÃO SILENCIAMENTO DE GENES SUPRESSORES DE TUMOR (HAHN & WEINBERG, 2002; LUO et al., 2009)

6. Carcinogênese Expanção clonal – câncer Dano ao DNA – mutação Céls. transformadas Falha mecanismos de reparo e na maquinaria apoptótica Agentes Citotóxicos Dano ao DNA Reparação de céls. com menor intensidade proliferativa DNA reparado Mecanismos de morte funcionantes Adaptado de ALLAN & TRAVIS, 2005

7. Apoptose TIPOS DE MORTE CELULAR Autofagia PS PS PS LC3 LC3 PS PS PS Necrose Catástrofe Mitótica

8. NECROSE Alterações mitocondriais Vacuolização Inchaço Célula normal Perda da integridade de membrana Extravasamento de mediadores inflamatórios Desintegração de organelas

9. APOPTOSE Formação de Blebs Fragmentação internucleossomal do DNA Diminuição do volume celular Condensação da cromatina Lise dos corpos apoptóticos Célula normal Formação dos corpos apoptóticos

10. Ações Importantes: • Promoção da saúde; • Detecção precoce; • Assistência aos pacientes; • Vigilância; • Formação de recursos humanos; • Comunicação e mobilização social; • Na pesquisa e gestão do SUS; • Desenvolvimento de tratamento mais eficazes. http://www.tendenciasemercado.com.br/

11. Terapias Anticâncer • Cirurgia • Radiação Ionizante • Imunoterapia • Terapia Dirigida • Quimioterapia Remoção da massa tumoral Mata rapidamente células tumorais em divisão, incluindo células tumorais nos tecidos adjacentes Terapia que se utiliza do sistema imune para combater o câncer Inibe especificamente os processos necessários para crescimento da célula tumoral Mata rapidamente células em divisão (tumorais e sadias) KUMAR et al., 2004

12. Quimioterapia • Definição: • Consiste em um tratamento a base de fármacos que interferem em diferentes processos tais como: desenvolvimento, crescimento, disseminação e invasão de células cancerígenas (Souza et al., 2007). • Objetivo primário: • Destruir células neoplásicas preservando células normais.

13. Produtos Naturais Síntese Química Plantas Organismos Marinhos Microorganismos Papaver somniferum Cryptotethya crypta PRODUTOS NATURAIS COM ATIVIDADE ANTICÂNCER Penicillium notatum

14. Vinca rosea Taxus brevifolia Camptotheca accuminata Drogas Anti-câncer Originadas de Plantas • Derivados da Vinca • Vimblastina • Vincristina • Vindesina • Taxanos • Paclitaxel • Docetaxel • Camptotecinas • Topotecano • Irinotecano • Podofilotoxinas • Etoposídeo • Tenoposídeo

15. Produtos Naturais x Derivados • Contudo há necessidade do desenvolvimento de novas drogas que reduzam os efeitos adversosdo tratamento; • O trabalho da química medicinaltem propiciado o surgimento de novos compostos, os quais tem levado a novos protótiposde drogas; (MARKMAN, 1998)

16. Produtos Naturais x Derivados Número de drogas Derivados de prod. nat. Produtos naturais Nº de Drogas Aprovadas nos EUA até 2007 anos Adaptado de LI & VEDERAS, 2010

17. Problemática da Quimioterapia • Esquemas terapêuticos falhos; • Altos índices de recidivas; • Redução da sobrevida de pacientes; • Efeitos adversos; • Resistência • Inerente • Adquirida http://www.mountnittany.org/wellness-library/healthsheets/documents?ID=4834

18. Mitracarpus Baturitensis Sucre (Rubiaceae) • Utilizadas para tratamento: • Hanseníase • Cefaléia • Dor de dente • Doenças venéreas • Dispepsia

19. OBTENÇÃO DA MOLÉCULA FR42 • Parte aérea seca (temp. Ambiente) • Triturada e submetida a extração exaustiva com hexano à frio seguida de EtOH. • Soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida. • Resultando: Extratos hexânicos e EtOH em gel de sílica benzoisoquinolina-5,10-diona (FR42)

20. Quinonas • Definição:Compostos oxigenados, formados a partir da oxidação de fenóis. Sua principal característica é a presença de 2 grupos carbonílicos formando um sistema conjugado. • Ampla e variada família de metabólitos de distribuição natural; • Amplo espectro de atividades biológicas: • Microbicida • Tripanossomicidas • Viruscidas • Antitumorais naftoquinona benzoquinona antraquinona

21. QUINONAS UTILIZADAS NA TERAPIA DO CÂNCER

22. MECANISMO DE AÇÃO DAS QUINONAS Inibição de Topoisomerase Geração de espécies reativas de oxigênio

23. Objetivos • Geral: Estudar o potencial citotóxico em células cancerígenas e os prováveis mecanismos de açãoda FR42 (benzoisoquinolina), isolada do Mitracarpus baturitensis, em ensaios in vitro.

24. Objetivos • Epecíficos: • Determinar a IC50da FR42 em um painel de linhagens celulares cancerígenas: através do ensaio de MTT. Além de células normais CMSP através do ensaio Alamar Blue. • Definir a citotoxicidade da FR42 sobre as células SF-295, através do ensaio de citotoxicidade em tempo real (XCELLligence) • Avaliar o provável mecanismo de ação da FR42 através de citometria de fluxo (integridade de membrana, fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial) a partir de células SF-295 (glioblastoma humano) tratadas com a benzoisoquinolina.

25. METODOLOGIARESULTADOS DISCUSSÃO

26. Repique em meio de cultura novo Manutenção das Linhagens Celulares 10mL Cultura de células 37°C / 5% de CO2 • Meio de cultura RPMI 1640; • 10 ou 20% de soro fetal bovino; • 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina); • 3% de fitohemaglutinina (linfócitos). Contagem/Observação

27. Cultura de células Células plaqueadas e drogas diluídas usando o HTS (Highthroughputscreening) Formasan 0,039 a 5µg/mL MTT 72 h 3 h Absorbância em 595nm Ensaio de Citotoxicidade em Células Tumorais e Não Tumorais – Teste MTT Contagem

28. Formazan Doadores de e- Redução Succinato NADH NADPH + MTT Citoplasma meio extra-celular Berridge & Tan, 1993

29. TESTE DE CITOTOXICIDADE EM CMSP ENSAIO DO ALAMAR BLUE Princípio: Baseia-se na redução do alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) por células viáveis à resorufina (róseo e altamente fluorescente), mensurando indiretamente a proliferação celular. Forma oxidada Forma reduzida

30. Ensaio de Citotoxicidade – MTT e Alamar Blue (CMSPH) – 72h

31. Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence).

32. Ensaio de citotoxidade em tempo real (xCELLigence). C-

33. ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO

34. CITOMETRIA DE FLUXO

35. CITOMETRIA DE FLUXO Diluição com Corante desejado FR42 48 h Células SF-295

36. Viáveis Não Viáveis CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS Princípio: Baseia-se na capacidade de o iodeto de propídeo penetrar as células cuja membrana esteja rompida e ligar-se ao DNA nuclear, emitindo alta fluorescência vermelha. Iodeto de propídeo não ligado Iodeto de propídeo ligado

37. CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS

38. G1 G2/M DNA Fragmentado CICLO CELULAR E FRAGMENTAÇÃO DO DNA DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE DNA Princípio: Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA. Assim, pode-se determinar as diferentes fases do ciclo celular, baseando-se pelo conteúdo de DNA. Quantidade de DNA por núcleo S 4n 2n G1 S G2 Interfase Mitose

39. FRAGMENTAÇÃO INTERNUCLEOSSOMAL DE DNA

40. CICLO CELULAR

41. POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA Princípio: Seqüestro da rodamina 123, um corante fluorescente nucleofílico, para dentro da mitocôndria quando esta apresenta seu potencial transmembrânico inalterado, emitindo, assim, alta fluorescência. Despolarizadas Polarizadas

42. POTENCIAL TRANSMEMBRÂNICO DA MITOCÔNDRIA

43. Microscopia Confocal SF-295 Tratar com os compostos testes 24h 24h 20.000 céls/poço Aspirar o meio e resuspender com 200 uL de meio novo Adicionar 4 uL da Anexina V/AlexaFluor568 Resuspende com 200 uL de meio novo Lavar com PBS 15 min – temp. ambiente Hoechst – 10 min

44. Externalização da fosfatidilserina – Anexina V/AlexaFluor 564 A B Vermelho: Anexina V/AlexaFluor 568 Azul: Núcleo/Hoechst33342 C D A Cont. Negativo (DMSO) B Doxorrubicina 0,3 uM C Droga 4 uM D Droga 8 uM Escala: 50 UM

45. CONCLUSÃO

46. OBRIGADO!