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ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIOR ENG. AGRÔNOMO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA FIT 00035 – FITOBACTGERIOLOGIA. PROJETO DE PESQUISA. Utilização de cartões FTA na extração e purificação de DNA para detecção molecular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola.

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ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIOR ENG. AGRÔNOMO

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  1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA FIT 00035 – FITOBACTGERIOLOGIA PROJETO DE PESQUISA Utilização de cartões FTA na extração e purificação de DNA para detecção molecular de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola ISMAIL TEODORO DE SOUZA JÚNIOR ENG. AGRÔNOMO

  2. Sumário • Introdução • Objetivo • Material e métodos • Hipóteses • Cronograma • Orçamento

  3. Equipe • Ismail Teodoro (UFRGS) • Valmir Duarte (UFRGS) • Dana Cruz (Agronômica) • Yiuliet Franco (U. Havana) • Daniela (UFRGS) 3

  4. Introdução • Importância da cultura de arroz 4

  5. Introdução • Produção Nacional 12 milhões de toneladas Conab, 2010 5

  6. Introdução • Alta produtividade; • Sementes de variedades híbridas; • Importação de sementes; • Controle da qualidade fitossanitária; • Política de quarentena – Arroz (27 pragas). 6

  7. Introdução • Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( 20-30% -50%); • X. oryzae pv. oryzicola (20 a 32 %); • Comprometimento da produção; • Detectadas em sementes importadas (Uruguai, EUA,China, Índia); • Adoção de métodos precisos de detecção. 7

  8. Introdução • Detecção • Ensaios biológicos , bioquímicos, sorológicos e moleculares; • Moleculares – oligonucleotídeos iniciadores; • A coleta de amostras e a purificação de DNA são passos, importantes para uma análise genética e diagnóstica. • Ácidos nucléicos (DNA ou RNA) com impurezas e de baixa qualidade podem comprometer o diagnóstico, onde amostras e fontes valiosas podem ser perdidas. 8

  9. Introdução • Os cartões FTA (FlindersTechnologyAssociates) • Rápida coleta, purificação e análise do material genético de uma ampla gama de materiais biológicos ; • Fixa e armazena os ácidos nucléicos diretamente dos tecidos frescos pressionados ou homogeneizados em tampão; • Mistura de reagentes, contendo tampões fortes, agentes desnaturantes de proteínas e quelantes de radicais livres. • Lisam as membranas celulares, envolvem o DNA , estabilizam e protegem o DNA de nucleases, oxidação e danos causados pela luz UV, e degradação fúngica e microbiana; 9

  10. Introdução • Aumenta a sensibilidade de detecção comparada a métodos de extração convencionais do DNA, além de propiciar a coleta de um grande número de amostras • Coleta, extração de DNA 9

  11. Introdução 11

  12. Objetivo Padronizar e validar um método de coleta e extração de DNA para detecção de Xanthomonas oryzae pv. oryzae e X. oryzae pv. oryzicola a partir de sementes de arroz. 13

  13. Material e métodos 14

  14. Estirpes bacterianas • Estirpes bacterianas de referência 15

  15. Extração de DNA das estirpes de referência pelo método do cartão FTA Crescimento 100 μL (10-1 a 10-8 ) Placa - UFC Armazenamento Secagem- 24 hs Disco 16

  16. Padronização e validação do método de coleta, transferênciade amostras de sementes e extração de DNA com o uso decartões FTA Trituração Lavagem Secagem- 24 hs Armazenamento 17

  17. Purificação do DNA dos cartões FTA SDS 0,5% Solução TE - 1 Solução alcalina (0,1 N NaOH; 0,3 mM EDTA, pH 13.0) Solução neutra (0,1 M Tris–HCl, pH 7.0). 18

  18. Oligonucleotídeos iniciadores 19

  19. Condição da PCR • 0,5 μl de 10 mM de DNTPs • 2,5 μl de 10 X de tampão • 2,0 μl de 25 mM de MgCl2 • 0,02 unidades de Taq polimerase • 0,5 μl de 10 μM de cada primer num total de 25 μl • 94 ºC/3min, (94 ºC/30s, 64 ºC/30 s e 72 ºC/ 90 s) x34 , 72 ºC /7 min • Gel de agarose a 2% - 60V/90min 20

  20. Hipóteses • As bactérias são detectadas por PCR nas menores concentrações; • O método do cartão FTA constitui de uma ferramenta para certificação de sementes e inspeção quarentenária; 12

  21. Orçamento 22

  22. Orçamento 22

  23. Cronograma 23

  24. Referências bibliográficas • Lang, J. M., Hamilton, J. P., Diaz, M. G. Q., Van Sluys, M. A., Burgos, M. R. G., Vera Cruz, C.M., Buell, C. R., Tisserat, N. A., and Leach, J. E. 2010. Genomics-based diagnostic marker development for Xanthomonasoryzaepv. oryzaeand X. oryzaepv. oryzicola. PlantDis. 94:311-319. • Whatman. FTA protocols: collect, transport, archive and access nucleic acids-all at room temperature; WB120047. Disponível em: <www.whatman.com>. Acesso em: 15 jun. 2010. • David O. Niño-Liu; Pamela C. Ronald; Adam J. Bogdanove. Xanthomonasoryzaepathovars: model pathogens of a model crop. Molecular PlantPathology, (2006) 7 ( 5 ) , p.303–324. • European and Mediterranean Plant Protection Organization. Xanthomonasoryzae. 2007 OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin37, 543–553 24

  25. OBRIGADOismail.teodoro@ufrgs.br

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