Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe

1. Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe • Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) • La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) • La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

3. Step 2: dalla trascrizione alla proteina 3’ 5’

4. Gli enzimi sono attivi solo se ripiegati nella conformazione corretta (folding)

5. Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Folding ossidativo

6. Soltanto il corretto appaiamento di residui di cisteina porta alla conformazione biologicamente attiva

7. Nel processo di folding hanno luogo modificazioni post-traduzionali: es. Glicosilazione

8. E. coli: nel citoplasma la formazione di ponti disolfuro è estremamente sfavorita • Il citoplasma ha un potenziale redox molto basso (ambiente riducente) • Nel citoplasma non ci sono enzimi che sono in grado di ossidare i tioli (-SH)

9. Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) +

10. Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

11. Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

12. Foldasi e chaperonine Foldasi: 1) prolil cis-trans isomerasi (es. ppiA) 2) disolfuro isomerasi (eucariotiche) Chaperonine

14. „Mettersi in riga“ o venire eliminati: il ruolo delle chaperonine

15. Struttura del complesso GroEL/GroES (una della maggiori chaperonine citoplasmatiche) A) Veduta laterale B) Veduta apicale e basale

16. DnaK

17. Alto livello di espressione + errata conformazione Inclusion bodies

18. Vettori per l‘espressione di chaperonine

19. Il successo si consuma a freddo: i vettori per espressione a basse temperature

20. Inclusion bodies: se li conosci li eviti • La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere meno riducente il citoplasma 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro

21. Inclusion bodies: se li conosci li eviti ma non necessariamente • La formazione di corpi di inclusione può essere ridotta: 1) crescendo a bassa temperatura (ad es. 16°C) 2) riducendo la velocità di espressione del gene 3) cercando di rendere un pò meno riducente il citoplasma 4) aumentando l’espressione di chaperonine o di enzimi che promuovono la formazione di ponti disolfuro • Possono essere il punto di partenza, una volta purificati per la preparazione di un proteina d’interesse

22. L’involucro dei batteri Gram negativi

23. Lo spazio periplasmico è un ambiente ossidante Gram+ L’aggiunta di peptidi segnale favoriscono il trasporto dal citoplasma allo spazio periplasmatico (es. MKTHRLNMTASLLIGISAFA ) La proteina periplasmatica DsbA induce la formazione di ponti disolfuro tra cisteine

24. Vantaggi - Crescita rapida - Elevata densità cellulare su substrati poco costosi Organismo molto ben caratterizzato e ricca collezione di mutanti Numero elevato di vettori di clonaggio ed espressione Svantaggi Formazione di inclusion bodies Folding ossidativo limitato allo spazio periplasmico Modificazioni post-traduzionali non adeguate (ad es. glicosilazione) Espressione di proteine ricombinanti in Echerichia coli

25. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

26. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

27. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

28. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

30. Rese di produzione Rese massime teoriche di una proteina d’interesse per litro di coltura a 109 cells/ml

31. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Raccolta delle cellule e lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

32. Raccolta: filtrazione e centrifugazione Per lisare le cellule: lisozima sonicazione French Press Nel caso di espressione periplasmatica si lisa solo lo spazio periplasmico con shock osmotico French Press

33. Schema generale di preparazione di una proteina ricombinante in E. coli 1) Clonaggio del gene (cDNA nel caso degli eucarioti) in un opportuno vettore d’espressione 2) Fase pilota su piccola scala: ottimizzazione dell’espressione al fine di ottenere la massima produzione di proteina solubile, o insolubile, se si sceglie la strada dei corpi d’inclusione 3) Scale-up: crescita su scala più ampia di una coltura di E. coli che esprime la proteina 4) Lisi delle cellule o solo dello spazio periplasmico 5) Purificazione della proteina d’ interesse mediante tecniche cromatografiche a partire dagli estratti grezzi citoplasmatici o periplasmici 6) Alternativamente, purificazione e denaturazione dei corpi d’inclusione. Rinaturazione in vitro della proteina d’interesse

34. Fusioni traduzionali possono aiutare il processo di purificazione della proteina d’interesse attraverso cromatografia d’affinità • Peptidi o proteine che possiedono affinità per un particolare substrato possono essere “fusi”alla proteina di interesse per facilitarne la purificazione • Possono essere fusioni con intere proteine (ad es. Maltose Binding Protein, Inteina, GST) • Oppure con piccoli epitopi (ad es. 6xHis, peptide FLAG)