Proteine della fase acuta e VES

1. Argomenti di Patologia Clinica Proteine della fase acuta e VES Proteine plasmatiche Patologia clinica delle malattie allergiche, infiammatorie ed autoimmunitarie

2. Infiammatori fisici (operazioni chirurgiche, ferite, fratture, ustioni, radiazioni) Infiammatori chimici (sostanze chimiche, tossici, allergeni) Infettivi (batteri, virus, funghi, parassiti) Necrotici (ischemia) Tumorali Immunitari (malattie autoimmuni, rigetto dei trapianti) LE PROTEINE DELLA FASE ACUTA Tutti gli esseri viventi hanno sviluppato numerosi meccanismi di controllo per preservare la loro individualità dagli stimoli provenienti dall’ambiente in cui vivono. Questi vari meccanismi omeostatici possono essere alterati da diverse cause. All’aggressione esterna, l’organismo risponde con una reazione normale immediata e transitoria, localizzata nella zona dell’intervento lesivo, caratterizzata da tutte le fasi del processo infiammatorio, con attivazione di leucociti, fibroblasti, cellule endoteliali e liberazione di numerosi mediatori chimici (citochine).

3. FASE ACUTA: vasta e complessa serie di risposte fisiologiche aspecifiche, che iniziano immediatamente dopo che l’organismo è stato colpito da un trauma, un’infezione o qualunque causa che produca danno. Anche se la risposta inizia ed è più evidente a livello locale, la risposta acuta deve essere considerata un processo dinamico che altera l’omeostasi e coinvolge quasi tutti gli organi, mediante meccanismi di automantenimento e di amplificazione la risposta infiammatoria si può accentuare, producendo uno stato patologico generalizzato. I mediatori, prodotti da cellule, agiscono su specifici recettori posti su cellule distanti dal luogo di secrezione reazione sistemica caratterizzata da: • febbre • anoressia e cachessia • leucocitosi • aumento della velocità di sedimentazione degli eritrociti (VES) • attivazione della cascata del complemento e della coagulazione • proliferazione dei linfociti • aumento dell’increzione di ormoni (ACTH e glicocorticoidi) • cospicua variazione della concentrazione di alcune proteine plasmatiche

4. RISPOSTA ACUTA SISTEMICA ORGANI E TESSUTI COINVOLTI EFFETTI IPOTALAMOfebbre, fattori liberanti ormoni ipofisari IPOFISIliberazione di tropine (ACTH, GH, ADH) ALTRE GHIANDOLE ENDOCRINEinsulina, glucagone, T3, T4, aldosterone,catecolamine MIDOLLO OSSEOleucocitosi SISTEMA IMMUNITARIOproliferazione linfocitaria SANGUEaumento delle immunoglobuline e della VES FEGATOproteine della fase acuta

5. Alle proteine plasmatiche che aumentano la loro concentrazione all’instaurarsi del processo infiammatorio viene dato il nome di PROTEINE DELLA FASE ACUTA Il fegato umano in condizioni fisiologiche sintetizza oltre 20 gr di proteine al giorno, riversate nel plasma e utilizzate come fattori di crescita, proteine di trasporto, proteine che intervengono nei processi di difesa dell’organismo. Durante l’infiammazione acuta si verifica un cambiamento del profilo biosintetico delfegato, che risponde con un’aumentata sintesi delle proteine della fase acuta e contemporaneamente riduce la sintesi e la concentrazione nel plasma di altre proteine, dette perciò PROTEINE “NEGATIVE” DELLA FASE ACUTA • proteggere, neutralizzando direttamente gli agenti infiammatori • ridurre l’estensione del danno • promuovere la riparazione e la rigenerazione dei tessuti • ristabilire l’omeostasi Molte proteine dellafase acuta provvedono a funzioni essenziali dell’organismo. Durante infiammazione

6. concentrazioni plasmatiche dei fattori del complemento e loro attivazione inibitori delle proteasi (1-antitripsina, 1-antichimotripsina) Prevengono perdita di ferro, che viene trasportato al fegato e non è più disponibile per la crescita dei batteri proteine leganti i metalli Neutralizzano l’attività delle proteasi liberate dai neutrofili e macrofagi, limitando la fase demolitiva dell’infiammazione Opsonine e fattori chemiotattici per neutrofili e macrofagi distruzione microrganismi patogeni: riparazione del danno e guarigione Previene o blocca l’emorragia , intrappola i microrganismi nel focolaio infiammatorio, inizia a promuovere la guarigione delle ferite fattori della coagulazione In genere la risposta della fase acuta dura solo pochi giorni, ma se la causa e l’infiammazione persistono, si ha il mantenimento e la progressione del danno tissutale Malattie cardiovascolari e deposito di proteine (amiloide)

7. PRINCIPALI PROTEINE DELLA FASE ACUTA (+) nell’uomo PRINCIPALI PROTEINE DELLA FASE ACUTA (—) nell’uomo • proteina C reattiva (PCR) • proteina siero amiloide A (SAA) • fibrinogeno (Fib) • aptoglobina (Ap) • 1-Glicoproteina Acida (1-GPA) • 1-antitripsina (1-AT) • 1-antichimotripsina (1 Achy) • ceruloplasmina (Cp) • albumina (Alb) • prealbumina (Prealb) • transferrina (Tf) • proteina legante il retinolo (RBP) • proteina legante i corticosteroidi (CBP) • apolipoproteina A1 (Apo A1) Vengono considerate proteine della fase acuta quelle il cui innalzamento della concentrazione plasmatica  25%.

8. LE PROTEINE “MAGGIORI” DELLA FASE ACUTA La Proteina C Reattiva (PCR) Il componente sierico P dell’amiloide (SAP) La proteina Sierica dell’amiloide A (SAA)

9. Proteine dalla caratteristica organizzazione PENTAMERICA costituita da subunità identiche formanti strutture ANULARI PENTAGONALI SUBUNITA’ PENTRAXINE PCR e SAP appartengono alla famiglia delle PENTRAXINE

10. SAP PCR SEMPLICI DOPPIE L’unità pentamerica è di p.m. 117,5 kDa La subunità 206 aa p.m. 23kDa L’unità pentamerica è di p.m.230 kDa La subunità 204 aa p.m. 21kDa Con 51% di identità nei loro amminoacidi

11. E’ stato identificata recentemente una nuova pentraxina, PTX3/TSG14, che ha una limitata omologia con la PCR e che è indotta negli epatociti, nei fibroblasti e nelle cellule endoteliali da IL-1ß o dal TNF-

13. PCR Trovata nel siero di pazienti affetti da polmonite pneumococcica, possedeva la capacità di legarsi (reagire) con il polisaccaride C dello Streptococcus pneumonie (pneumococco). E’ una molecola di riconoscimento che possiede la proprietà di formare legami specifici calcio-dipendenti con molti substrati agisce come opsonina per batteri, parassiti e complessi immuni Attiva la via classica del complemento, si lega alla cromatina, agli istoni ed a piccole particelle riboproteiche. In pratica, il suo legame a cellule o a detriti nucleari, contribuisce ad eliminare materiale che potrebbe far persistere l’infiammazione e produrre reazioni specifiche autoimmunitarie contro antigeni nucleari

14. SAP è la forma circolante del componente P dell’amiloide (AP) che si ritrova in tutti i tipi d’accumulo di sastanza amiloide. E’ un elemento normale delle membrane basali glomerulari e si ritrova nelle aree microfibrillari del tessuto elastico che circonda i vasi sanguigni. Ha in comune con la PCR la capacità di legame calcio-dipendente e diverse attività biologiche

15. IL-6 e IL-1 Nel topo la sintesi di queste due proteine è stimolata da: Effetto sinergico sulla PCR Effetto additivo sulla SAP Metalli Pesanti (Cd, Pb, Cu, Zn ecc.) inducono la sintesi di PCR Per PCR stata dimostrato anche un controllo post-traduzionale. Aumento di secrezione da parte degli epatociti di coniglio nella fase acuta, dovuta dalla regolazione negativa di uno specifico sito di legame che trattiene la PCR nel RE in condizioni normali . Inoltre le proteasi rilasciate dai neutrofili inducono la degradazione della PCR facendone diminuire la quantità.

16. In assenza di infiammazione, la concentrazione di PCR nel plasma è inferiore a 1μg/ml e non sembra diminuire o aumentare con l’età. L‘aumento durante l’infiammazione avviene a livello trascrizionale, prevalentemente nelle cellule epatiche, ma la sintesi si osserva anche nei linfociti T ad attività NK. Il TGF-β fa cessare completamente la sintesi di PCR stimolata dalle citochine. L’aumento della PCR si osserva dopo 9 ore (ed aumenta di 100-1000 volte) dall’inoculo di lipopolisaccaride (LPS) o durante i processi infiammatori per poi diminuire entro 18 ore dalla fine spontanea o dal controllo terapeutico della reazione acuta.

17. La SAP non è una proteina semplice come la PCR ma contiene unità carboidratiche (12%); È un reagente positivo della fase acuta nel topo con un picco a 24-36 ore, ma non aumenta o aumenta di poco nell’uomo durante una malattia infiammatoria, il che significa che il gene umano ha perduto la capacità di rispondere a segnali infiammatori. La concentrazione alla nascita nel sangue di cordone ombelicale è di 4μg/ml ed aumenta nel plasma dopo una settimana di vita. Le concentrazioni normali in età adulta sono di 20-50μg/ml con valori più bassi nella donna di 10μg/ml. La sua emivita è di 8-9 ore il che dimostra la sua rapida e continua sintesi da parte del fegato.

18. La SAP è usata per diagnosticare, localizzare e valutare l’estensione dei depositi d’amiloide reattiva (secondaria) mediante scintigrafia dopo iniezione di SAP marcata con I123 nei pazienti con amiloidosi sistemica. In tale amiloidosi, infatti, la SAP si lega (legame calcio-dipendente) alle fibrille originatesi da un’altra proteina plasmatica chiamata AMILOIDE SIERICA A (SAA)

19. SAA è un nome collettivo dato ad una famiglia di proteine polimorfiche che sono codificate da geni multipli in diverse specie animali. I geni SAA hanno un’organizzazione in parte comune ai geni di altre apolipoproteine. I geni SAA umani sono tutti aggregati sul braccio corto del cromosoma 11;

20. Funzioni della SAA considerate benefiche durante la fase acuta sono: • L’induzione della produzione di collagenasi da parte di fibroblasti sinoviali di coniglio e quindi azione favorente la riparazione del danno • Il legame dei lipopolisaccaidi dei batteri e loro eliminazione • Inibizione della produzione di sostanze ( IL1-bea, TNF alfa ) che inducono febbre, l’inibizione dell’attivazione piastrinica • La SAA ha anche un ruolo immunologico durante l’infiammazione in quanto inibisce la funzione dei linfociti Th e l’interazione cellule T- macrofagi. La concentrazione di SAA aumenta di 500-2000 volte durante la fase acuta con un picco a 9 ore e la sua sintesi è indotta, oltre che nel fegato, anche nel rene, ileo, polmone, milza, cuore, testicoli e macrofagi.

21. Gli induttori sono: iL-1 che induce di circa 10 volte il TNF che induce di circa 5 volte Contemporaneamente all’induzione della SAA si osserva una diminuzione della sintesi dell’albumina (reattivo negativo della fase acuta). Studi su popolazione normale hanno mostrato che i livelli di SAA aumentano leggermente ma costantemente nel siero con l’avanzare dell’età, fino a 70 anni. La persistente produzione di SAA e SAP nelle infiammazioni croniche porta, ma non sempre, ad amiloidosi secondaria ( o reattiva) che complica moltissime malattie infiammatorie croniche o ricorrenti.

22. Depositi di fibrille di amiloide correlati alla proteina SAA, si hanno anche nella febbre mediterranea familiare (FMF), malattia genetica prevalente in alcuni gruppi etnici. Vi sono prove che le mutazioni genetiche e le infiammazioni croniche favoriscono la sintesi di proteine SAA, che più facilmente si trasforma in fibrille d’amiloide. La ricerca di mediatori che riducono la sintesi di queste proteine, potrà far raggiungere l’obiettivo di diminuire la progressione dell’accumulo di sostanze amiloide.

23. SIGNIFICATO ED UTILITA’ DELLE PROTEINE DELLA FASE ACUTA NELLA CLINICA Le PFA mettono in evidenza un qualsiasi danno tissutale altrimenti non rilevabile inducono il clinico a cercarne: le cause, il tempo di insorgenza di questo stato di malattia, la sua durata e la sua estensione.

24. PRIMA DIFFICOLTA’ Selezione delle PFA in quanto il tempo d’insorgenza dallo stimolo lesivo, la velocità di aumento della concentrazione plasmatica ed il picco raggiunto dalle diverse proteine, differiscono notevolmente. SECONDA DIFFICOLTA’ Differente risposta della fase acuta nelle diverse malattie, sia in termini qualitativi che quantitativi. TERZA DIFFICOLTA’ metodo di misurazioni che non per tutte le determinazioni proteiche sono ,veloci, semplici, accurati e poco costosi.

25. La PAF più utilizzata nella pratica clinica è la Proteina C reattiva perché è normalmente presente in minime quantità, la sua risposta è pronta e sensibile, non va in contro a processi di sequestro e degradazione locali, quindi la sua rapida cinetica ed i suoi limiti ematici corrispondono alla reale risposta biosintetica e rilevano quindi un processo patologico in atto. Pochi sono i processi patologici che non producono incrementi plasmatici di questa proteina (sia ad elevati o anche a modici innalzamenti) Altre proteine della fase acuta come il fibrinogeno sono più lente a comparire e possiedono una cinetica completamente diversa e quindi non sono adatte a cogliere precocemente l‘inizio di una minima alterazione.

26. La PCR aumenta nei traumi (fratture, interventi chiururgici, ustioni) L’aumento si riscontra già nella 6a-8a ora, raggiungono il picco a 24-48 ore per poi discendere velocemente ai livelli basali entro 96 ore o al massimo, una settimana.. Il dosaggio quindi può essere utile per stabilire una prognosi a brevissimo termine. Se insorgono complicazioni infettive, i valori di PCR o si mantengono costantemente elevati o, se già normalizzati, riprendono a salire.

27. CAUSE DI AUMENTO DELLA PCR Infezioni batteriche Infiammatorie non infettive Processi necrotici Infettive virali Parassitarie Neoplasie

28. VELOCITA’ DI ERITROSEDIMENTAZIONE (VES)

29. Se il sangue periferico prelevato è reso incoagulante e lasciato in una provetta, i suoi globuli rossi tendono a sedimentare spontaneamente. Già gli antichi greci osservarono che gli eritrociti del sangue periferico di persone gravemente ammalate sedimentavano al fondo del contenitore più rapidamente degli eritrociti del sangue di persone normali con formazione di un deposito scuro chiamato “bile nera”

30. L’influenza del campo gravitazionale terrestre è osservabile solo con particelle sufficientemente pesanti e se queste sono sospese in un mezzo fluido, la velocità finale di caduta è determinata da bilancio tra la forza gravitazionale e la resistenza di attrito del mezzo fluido al movimento della particella. La velocità gravitazionale delle emazie nel campo gravitazionale terrestre dipende dal peso specifico delle emazie che è superiore di poco a quello del mezzo in cui sono sospese, il plasma.

31. La velocità di sedimentazione secondo la legge di Stokes per particelle ideali sferiche è il doppio del quadrato del raggio, questa legge può essere ritenuta valida anche nel caso di particelle non sferiche e molto concentrate come i globuli rossi e che tendono ad aggregarsi o come si dice ad “impilarsi”, cioè a formare degli ammassi simili a pile di monete ( detti in francese rouleaux) allineati lungo un singolo asse perpendicolare al piano della cellula. Tanto più le emazie si organizzano in questo modo, tanto più aumenta la loro velocità di sedimentazione

32. Pertanto la VES non indica soltanto una variazione delle proteine del plasma, ma riflette anche le variazioni dell’ematocrito e dipende dalla deformità ed aggregabilità delle emazie. Infatti la sedimentazione dipende anche da: Concentrazione delle particele Dalla temperatura (in genere sopra 20°C la legge di Stokes non funziona) Dalle variazioni di densità delle particele. La tendenza delle emazie ad aggregarsi dipende in parte dalla loro forma e dimensione: le normali emazie biconcave tendono ad aggregarsi più facilmente delle emazie caratteristiche di alcune anemie, (con sferocitosi, acantocitosi, falcemia) in cui si dovrebbe avere un ritardo di VES.

33. Anche la concentrazione delle emazie, che condiziona la viscosità del sangue, tende ad influenzare la VES: la policitemia fa aumentare la viscosità e quindi la tendenza delle emazie a rimanere in sospensione ritardando la VES, al contrario le anemie gravi accelerano la VES ( in assenza di altri fattori se l’ematocrito è inferiore al 20%)

34. La poca predisposizione delle emazie normali ad aggregarsi dipende principalmente dal fatto che : La forza di Van der Waals che favorisce la coesione tra le emazie, è bilanciata o in parte superata dalle cariche negative della membrana cellulare (potenziale zeta) che tendono a respingere le emazie. Nei g.r. il potenziale zeta (strato di cariche che possono essere dello stesso segno o di segno opposto) va da 20 a 25 MV, le proteine dissolte o adsorbite sulla superficie del g.r. abbassano il potenziale zeta; ad un potenziale di 15 MV si ha aggregazione eritrocitaria

35. Le proteine fibrose asimmetriche (fibrinogeno α e γ-globuline) determinando una ragnatela tra le particelle, fanno aumentare la viscosità e quindi si dovrebbero opporre alla sedimentazione, ma poiché formano grossi aggregati (con le loro cariche positive diminuiscono il potenziale zeta), esse favoriscono la sedimentazione.

36. La determinazione della VES , è stata introdotta come test clinico negli anni ’20 ed è da considerare un test diagnostico aspecifico ed indiretto di presenza di risposta della fase acuta. Durante la fase acuta aumenta nel plasma la quantità di proteine ad alto peso molecolare, soprattutto fibrinogeno, molecola lunga ed asimmetrica ed in parte anche molecole poco simmetriche come le globine, che fanno aumentare la velocità di sedimentazione delle emazie. Poiché il tempo di risposta del fibrinogeno è di 24-48 ore dall’inizio dell’infiammazione, l’aumento della VES non coincide con l’insorgenza del processo patologico ma solo dopo questo tempo di latenza e tenderà a normalizzarsi alcuni giorni dopo l’effettiva regressione della fase acuta.

37. I valori normali della VES variano in rapporto all’età ed al sesso 1-3 mm in 1 ora per l’uomo 4-7 mm in 1 ora per la donna con un incremento durante le mestruazioni. I bambini tendono ad avere valori più alti del normale, anche superiori a 20.

38. I fattori analitici che possono far variare o falsare la VES. L’eccessiva quantità d’anticoagulante (citrato di sodio) rallenta la sedimentazione. Come già accennato (Legge di Stokes), la temperatura ambiente deve essere di 18-20°C: temperature superiori aumentano, le inferiori rallentano e quindi se il sangue è stato conservato in frigorifero deve essere riportato a temperatura ambiente prima di eseguire la prova. Comunque il sangue deve essere utilizzato entro le due ore dal prelievo e non deve essere emolizzato e deve essere accuratamente risospeso prima di montarlo in provette per evitare fenomeni di aggregazione. La pipetta deve essere asciutta e messa in posizione perfettamente verticale perché l’umidità e l’inclinazione fanno aumentare la VES.

39. Attualmente la misurazione avviene dopo un ora di sedimentazione ed è stata abbandonata la lettura alla 2a ora e l’espressione dei risultati secondo l’indice di Katz; poiché non fornisce migliori indicazioni rispetto alla sola lettura alla prima ora, anzi nei casi di aumento della VES si osserva un valore erroneamente basso alla 2a ora.

40. Infatti l’’aggregazione eritrocitaria si svolge in tre fasi: • Iniziale formazione di piccoli aggregati • Sedimentazione degli aggregati a velocità costate • Impaccamento degli aggregati al fondo della pipetta, • Nei forti aumenti della VES l’impaccamento avviene molto più velocemente e si sa che l’impaccamento, e il conseguente aumento della viscosità, riduce la sedimentazione.

42. 1-3mm in 1 ora per l’uomo 4-7mm per la donna I bambini tendono ad avere valori più alti del normale, anche superiori a 20. RIASSUMENDO Da un punto di vista fisico i globuli rossi vengono spinti a sedimentare dalla forza di gravità, proporzionale alla massa e al volume cellulare, contrastata dalla forza di galleggiamento; la massa perciò aumenta quando le cellule si aggregano. L'aggregazione è di norma ostacolata dalla carica negativa della superficie, che fa sì che gli eritrociti si respingano tra loro: è possibile però che tale negatività si neutralizzi quando sono presenti nel plasma proteine a carica positiva che favoriscono perciò l'impilamento delle emazie.Si spiega in tal modo l'aumento della VES nelle situazioni fisiologiche o patologiche che implicano un aumento di fibrinogeno e globuline plasmatiche

43. Quindi la determinazione della VES è una prova di valutazione delle proteine della fase acuta poco costosa e semplice da eseguire. E’ però difficile la sua standardizzazione in quanto: I campioni non sono stabili I risultati non sono disponibili prima di un ora Espone gli operatori ad un possibile rischio biologico Inoltre la VES non riflette solo la variazione delle proteine plasmatiche giacché dipende in parte anche dalla componente eritrocitaria.

44. Per questi motivi si pensa di sostituire la VES con la determinazione della viscosità plasmatica che mostra gli stessi effetti della VES dopo 24 ore dall’inizio della risposta di fase acuta. A differenza della VES la viscosità plasmatica non risente della concentrazione, della deformità e dell’aggregazione eritrocitaria Inoltre i campioni sono stabili a temperatura ambiente per 4 giorni e la risposta del laboratorio può essere fornita nel giro di pochi minuti

45. La VES e’ un indice aspecifico di malattia e non costituisce nemmeno un indice specifico di fase acuta. INFATTI L’AUMENTO DELLA VES SI HA PER: Processi infiammatori non infettivi Altri processi patologici Patolgie infettive Processi necrotici Neoplasie

46. NORMALE O LIEVE AUMENTO TUBERCOLOSI POLMONARE ATTIVA TIFO BRUCELLOSI EPATITE VIRALE ALTRE MALATTIE VIRALI NON COMPLICATE ALLERGIE APPENDICE ACUTA TOXOPLASMOSI ACQUISITA DIMINUZIONE ANEMIE IPERCROMICHE TALASSEMIA MINOR POLICITEMIA IPOFIBRINOGENEMIA AFIBRINOGENEMIA LINFOGRANULOMA BENIGNO

47. INDICAZIONI DIAGNOSTICHE La VES va richiesta se si sospetta una malattia proliferativa, necrotizzante o infettiva; in tutti questi casi è buona norma associare anche l'analisi della Proteina C Reattiva

48. Argomenti di Patologia Clinica Queste diapositive sono state realizzate per i Corsi di Medicina di Laboratorio e di Patologia Clinica dellaFacoltà di Medicina dell’Università di Torino Nel caso riscontraste errori o inesattezze potete inviare una e-mail all’indirizzo patclin_unito@yahoo.itNel caso voleste utilizzare queste diapositive per i vostri corsi vi saremmo molto grati se lo segnalaste allo stesso indirizzo di posta.