Thèse de doctorat vétérinaire

1. Thèse de doctorat vétérinaire « Etude de la cellule souche d’organe présente chez le sang du chien et la rate de la souris » Françoise QUINTIN COLONNA Gilbert MOUTHON Marie-Louise LABAT Yoann DÉSIR

2. Introduction PLAN I. Etude bibliographique 1. Une cellule souche adulte pluripotente présente dans le sang de l'Homme 2. De l’homme à la souris : pourquoi une étude chez l’animal ? 3. Qu'est-ce que la crète neurale ? II. Etude expérimentale chez la Souris et le Chien 1. Matériel et méthodes 2. Résultats 3. Discussion Conclusion

3. INTRODUCTION Cellules souches « totipotentes » ¤ capacité à donner l’organisme entier ¤ potentiel de différenciation vers tous les types cellulaires (y compris le placenta) Cellules souches « pluripotentes » ¤ capacité à donner les cellules de l’endoderme, du mésoderme et de l’ectoderme ¤ impossible d’engendrer les cellules du trophoblaste Cellules souches adultes ¤ découvertes relativement récemment ¤ potentiel de 50 à 70 divisions au cours de la vie ¤ elles donnent des types cellulaires variés, d’où un caractère « multipotent » Cellules souches d’organe ¤ caractère « pluripotent » c’est-à-dire capables de donner des types celllulaire d’un feuillet embryonnaire différent de celui de l’organe où on les trouve. ¤ capacité de circulation dans l’organisme et de transdifférenciation pour réparer les lésions. ¤ potentiel de division restreint par opposition aux cellules souches embryonnaires. ¤ régulation originale par des lymphocytes T CD4+ « phagiques ».

4. Etude bibliographique d’une cellule souche adulte pluripotente présente dans le sang de l’homme 1991 : Labat et coll. étudient l’ostéomyélosclérose et la maladie d’Engelmann : Mise en évidence de la différenciation de monocytes en fibroblastes ¤ monocytes : immunofluorescence identifiant HLA-DR (CMH II), CD14 (LPS) et CD68 ¤ fibroblastes : produisant la prolyl-4-hydroxylase

5. Etude bibliographique • 1991 à nouveau : Labat et coll. : cas humain de mucoviscidose Différenciation de monocytes sanguins en « néofibroblastes » (cultures d’échantillons sanguins sur 30 jours) ¤ monocytes : identifiés par HLA-DR (CMH II), CD14 (LPS) et CD68, mais aussi par l’activité d’enzymes estérases non-spécifiques ¤ fibroblastes : produisant la prolyl-4-hydroxylase mais plus d’estérases Stimulation des lymphocytes T par la Phytohémagglutinine A puis l’Interleukine 2 : ¤ survie plus longue des lymphocytes T stimulés ¤ absence de différenciation des monocytes en fibroblastes

6. Etude bibliographique 1992 : investigation du mécanisme de contrôle par les lymphocytes T (Labat et coll.) ¤ coupes cellulaires : contacts intimes entre les néofibroblastes et les lymphocytes T ¤ présence de noyaux de lymphocytes T dans les cellules différenciées ¤ étude de l’influence humorale : le milieu de culture stimule les néofibroblastes au lieu de les inhiber Conséquence : l’interaction régulatrice lymphocyte T / néofibroblaste apparaît de nature cellulaire.

7. Etude bibliographique 1994 : un cas de greffe cardiaque corrobore les hypothèses de régulation par les lymphocytes T (Labat et coll.) ¤ traitement immunosuppresseur par la ciclosporine ¤ lymphocytes T inhibés ¤ prolifération de néofibroblastes non-régulés ¤ d’où explication de la fibrose pulmonaire rencontrée chez le patient

8. Etude bibliographique 1995 : un cas de vitréorétinopathie humaine (Reuter et coll.) où les monocytes se différencient en fibroblastes ¤ recherche de l’origine de la prolifération de fibroblastes dans cette maladie par emploi d’humeur vitrée de veau ¤ mise en évidence de marqueurs CD11c, CD18 et CD68 qui marquent les monocytes/macrophages ¤ d’où explication de la fibrose du corps vitré

9. Etude bibliographique 1997 : un cas de chondrosarcome (Labat et coll.) où les monocytes se différencient en fibroblastes et en cellules ressemblant à des chondrocytes ¤ mise en évidence de marqueurs HLA-DR, CD14 (monocytes/macrophages) mais aussi prolyl-4-hydroxylase et collagène I, II et III (fibroblastes) ainsi qu’une activité phosphatase alcaline (ostéoblastes et chondrocytes avant minéralisation) ¤ hypothèse d’une déficience in vivo des lymphocytes T (rétrovirus) qui explique la prolifération des néofibroblastes qui prennent une apparence de chondrocytes et forment des nodules.

10. Etude bibliographique 2000 : mise en évidence du polymorphisme des néofibroblastes révélant des marqueurs d’origine neurale par immunofluorescence (Labat et coll.) ¤ à partir de cellules sanguines de donneurs en bonne santé, sans facteurs de croissance ¤ polymorphisme : aspect fibroblastique, cellule radiée, forme amiboïde, cellule en tige, forme avec de longs filopodes. ¤ marqueurs d’origine neurale : synaptophysine, neurofilament NF160, Neurone-Specific Enolase (NSE), protéine S100. ¤ autres marqueurs : vimentine, fibronectine, Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP). hypothèse : origine de ces cellules dans la crète neurale

11. Etude bibliographique Les cellules monocytoïdes : • Polymorphisme physiologique et origine dans la crète neurale • Potentiel de différenciation en : ¤ néofibroblastes (culture sanguine physiologique) ¤ (évent.) cellules microgliales (synthétisant naturellement la lipocortine 1) venant du tube neural ¤ ostéoblastes (ostéomyélosclérose) ¤ chondrocytes (chondrosarcome) ¤ myofibroblastes (fibrose pulmonaire) ¤ cellule sécrétant de l’uromoduline (fibrose vésicale) ¤ cellule synthétisant une matrice extracellulaire PrP-like (tremblante ovine) Conclusion : existence de cellules multipotentes, ectomésenchymateuses, capables de prolifération, conjointement aux cellules souches mésenchymateuses.

12. Etude bibliographique 2000 : Zvaifler et coll. : cellules sanguines mésenchymateuses précurseurs (BMPC) ¤ prennent un aspect fibroblastique en culture à long terme ¤ sans CD14, ni CMH II, ni CD34 (marqueur de moelle osseuse) ¤ avec supplément ostéogénique : aspect ostéoblastique, expression de phosphatase alcaline et de Bone Morphogenetic Protein (BMP) ¤ potentiel de différenciation en adipocytes soudanophiles 2001 : Pittenger : cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse ¤ potentiel de différenciation en myoblastes, chondroblastes, adipocytes ¤ donnant les cellules musculaires lisses, en commun avec les cellules monocytoïdes ¤ sans CD14 ni CMH II Conclusion : deux types de cellules souches apparentées, mais distinctes de celles décrites par Labat et coll.

13. Etude bibliographique 2001 : prise de vue micro-cinématographique des lymphocytes T attaquant in vitro les cellules monocytoïdes (Labat et coll.) ¤ circulation des lymphocytes T autour des cellules monocytoïdes différenciées ¤ adhésion cellulaire puis passage des lymphocytes à travers la membrane plasmique des cellules cibles ¤ circulation des lymphocytes T dans le cytoplasme des cellules monocytoïdes, qui prennent un phénotype allongé ¤ interaction destructrice avec le cytosquelette ¤ explosion des cellules monocytoïdes ¤ libération des lymphocytes T phagiques qui peuvent agir de nouveau. Il s’agit d’une régulation immunologique originale. Les lymphocytes T phagiques peuvent (peut-être) sculpter in vivo les sites de réparation lésionnels pour éviter les proliférations excessives.

14. Etude bibliographique 2003 : Zhao, Glesne et Huberman : f-MΦ (macrophages fibroblastiques) ¤ stimulation par le M-CSF de cellules sanguines d’où différenciation en f-macrophages ¤ selon les facteurs de croissance : - LPS : macrophages - IL-2 : lymphocytes T CD8+ voire CD4+ - EGF : cellules épithéliales - NGF : cellules d’aspect neuronal - VEGF : cellules endothéliales ¤ stimulation clonale des f-macrophages : Différenciation en cellules hépatiques, endothéliales, neurales, epithéliales ou en lymphocytes. CONCLUSION : Il existe donc dans le sang de l'Homme une cellule souche pluripotente, circulant sous l'apparence d'un monocyte, et régulée par un mécanisme immunologique tout à fait original.

15. 2. De l’homme à la souris et au chien : pourquoi une étude chez l’animal ? 1989 et 1992 : Godoy et coll. décrivent chez la souris la différenciation de macrophages en cellules d’aspect fibroblastique (cas de schisostomose chronique) 2002 : stage au laboratoire d’immunologie : la même cellule est retrouvée chez le chien (échantillons sanguins) et étudiée chez la souris (prélèvements de rate) : Coloration par cytochimie : May-Grünwald et Giemsa Estérases non-spécifiques Immunofluorescence indirecte : neuron-specific enolase autres marqueurs des cellules nerveuses dont la nestine neurofilament NF160

16. 3. Qu’est-ce que la crète neurale ? Origine de la crète neurale : ¤ détachement de la plaque neurale au cours de la 4ème semaine de développement ¤ migration des cellules vers les différents tissus de l’embryon Différenciation des cellules issues de la crète neurale en : ¤ cellules nerveuses des ganglions rachidiens et sympathiques ¤ cellules de la médullo-surrénale et cellules endocrines à ACTH et à calcitonine ¤ cellules pigmentaires ¤ cellules à l’origine des os du crâne ¤ certaines cellules souches d’organe

17. Etude expérimentale chez la souris et le chien 1. Matériel et méthodes • Réactifs et matériels de culture Origine des différentes substances et réactifs (Prolabo, Gibco, Sigma, Histologie ENVA) • Anticorps utilisés : - NSE : anticorps monoclonal de souris - Synaptophysine : anticorps de souris et de lapin polyclonal - Nestine : anticorps monoclonal de souris

18. ETUDE EXPERIMENTALE • Mise en culture à long terme des cellules de rate de souris : • Souris C57B6 • Milieu pendant 3 semaines : RPMI + serum de veau fœtal + AB • Culture de cellules sanguines de chien : • Isolement par centrifugation des cellules mononucléées • D’où deux types cellulaires primordiaux : monocytes d’origine médullaire qui survivent quelques jours, et cellules monocytoïdes d’origine neurale supposée, observés pendant 3 semaines.

19. ETUDE EXPERIMENTALE • Stimulation des lymphocytes T canins et murins par la PHA, la Concanavaline A et l’ IL-2 : • PHA ou ConA (mitogènes) d’où activation polyclonale • Puis stimulation par l’IL-2 après 3 jours de culture qui évite l’apoptose des lymphocytes T • Immunofluorescence indirecte : • Fixation par l’acétone et le formaldéhyde, d’où perméabilité membranaire et visualisation de composés cytosoliques • Blocage des sites non-spécifiques à l’aide de serum de chèvre (l’anticorps secondaire ne les reconnaîtra pas) • Incubation 1 heure avec l’anticorps primaire • Incubation 1 heure avec l’anticorps secondaire fluorescent de chèvre

20. ETUDE EXPERIMENTALE Cytochimie • Coloration au May-Grünwald et Giemsa : • Colorant de May-Grünwald (fixation 3 min) • Eau distillée tamponnée pH 7,2 (rinçage 1 min) • Colorant de Giemsa (coloration pendant 20 min) • Coloration des estérases non-spécifiques : • Hydrolyse de l’alpha-naphtylbutyrate en composé rouge par les estérases • Contre-coloration en bleu par le vert de méthyle • Les cellules monocytes et monocytoïdes sont rouges • Les lymphocytes apparaissent bleus

21. RESULTATSMise en culture chez le Chien Cellules souches monocytoïdes sans coloration : - Témoin cellules : « œuf sur le plat » et « à dendrites » - Attaque des cellules monocytoïdes par des lymphocytes T (2 heures) :

22. RESULTATSMise en culture chez le Chien Cellules souches monocytoïdes sans coloration : - Cellules monocytoïdes reconnues par des lymphocytes T stimulés par PHA et IL2 : - Destruction d’une cellule monocytoïde par les lymphocytes T stimulés :

23. RESULTATSCaractérisation par cytochimie Coloration de May-Grünwald et Giemsa : - Les cellules adhérentes périphériques sont à gros noyau basophile : ce sont soit des lymphocytes T phagiques, soit des cellules souches peu différenciées. Coloration par les estérases non-spécifiques : - sans mitogène : Les lymphocytes T sont distingués par la coloration au vert de méthyle, et adhèrent aux cellules monocytoïdes rouges.

24. RESULTATSImmunofluorescence chez la souris Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la synaptophysine De grandes cellules à longs prolongements témoin anticorps secondaire : les cellules sont marquées par la synaptophysine en IF indirecte. ne sont que peu marquées par la fluorescéine.

25. RESULTATSImmunofluorescence chez la souris Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la synaptophysine (2) La morphologie des cellules spléniques varie : de grandes cellules rondes à gros noyau voisinent d’autres cellules plus effilées à longs prolongements.

26. RESULTATSImmunofluorescence chez la souris Immunofluorescence indirecte : mise en évidence de la neuron-specific enolase (NSE) Les cellules spléniques affichent un noyau très fluorescent : en raison de la technique utilisée, les anticorps peuvent marquer la NSE présente aussi sur la membrane nucléaire.

27. RESULTATSImmunofluorescence chez la souris Immunofluorescence indirecte : témoin anticorps secondaire (γNSE) Sans l’anticorps anti-γNSE, les cellules spléniques sont peu fluorescentes ; l’expérience est donc significative : les cellules spléniques mises en culture sont porteuses de la γNSE.

28. DISCUSSION Mise en évidence chez le chien comme chez la souris : - cellules de phénotype variable : rondes à grand noyau, ou allongées avec de longs filopodes - durée de vie : de l’ordre de 3 semaines, sans facteurs de croissance spécifiques. Caractérisation : - cellules dites « monocytoïdes » car estérases + - cellules sanguines et lymphatiques d’origine neurectodermique car porteuses de marqueurs d’origine neurale (absents des monocytes) : nestine, NSE, synaptophysine. Mécanisme de régulation : Identique à celui décrit par Labat et coll. chez l’homme ? Arguments : - adhésion cellules monocytoïdes / lymphocytes - lyse des cellules, qui prennent alors souvent un phénotype allongé

29. Conclusion Découverte de cellules souches d’organe riche en enseignements : - possibilité de régénération des organes à l’âge adulte - circulation des cellules souches sous l’aspect d’un monocyte dans le sang et la lymphe, ainsi que les organes lymphoïdes II comme la rate. Mécanisme de régulation fascinant : - fusion des cellules régulatrices, appelées « lymphocytes T phagiques », avec les cellules cibles - circulation des lymphocytes dans les cellules à stopper de manière à les lyser exception à la tolérance au "soi " puisque les cellules immunitaires détruisent physiologiquement des cellules naturelles. Hypothèses pour la reconnaissance : - reconnaissance impliquant le TCR des lymphocytes T qui serait peut-être de type γδ - différenciation des cellules cibles en exprimant un marqueur reconnu par les LT phagiques, comme CD 34 par exemple, qui aboutirait à la lyse des cellules en excès.

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37. Remerciements : Françoise Quintin Colonna, Professeur à l'Ecole Vétérinaire de Maisons-Alfort Marie-Louise Labat, Directrice de Recherche au C.N.R.S. Françoise Gavard, Responsable de Laboratoire à l’E.N.V.A. Gilbert Mouthon, Directeur de thèse et Professeur à l’Ecole Vétérinaire de Maisons-Alfort Naïma Kasbaoui, Docteur vétérinaire Carole Sapède, Docteur vétérinaire Laure Moro, Docteur vétérinaire Manuel Giovanetto, Docteur vétérinaire