BiO 304 Moleküler Biyoloji

1. BiO 304 Moleküler Biyoloji Dr. Hatice MERGEN

2. Nükleik Asitler • DNA ve RNA olmak üzere iki grupta toplanır. • Nükleotid denilen alt birimlerden meydana gelmiştir. • NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT

3. NükleotiDler-NükleikAsitlerin Yapı Taşları Nükleotid= azotlu baz + pentoz şekeri ( 5 karbonlu) + fosfat grubu içerirler

4. AZOTLU BAZLAR: İKİ ÇEŞİTTİR • 9 atomlu, iki halkalı pürinler (Adenin, Guanin) • 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler (Sitozin, Timin, Urasil) • A,C,G,T ve U şeklinde simgelenirler. • A,G,C DNA ve RNA’da ortak bulunur • T->DNA’da, U->RNA’da bulunur.

5. Şeker= Pentoz • Nükleik aside adını taşıdığı şeker verir. • Ribonükleik asitlerde-RİBOZ • Deoksiribonükleik asitlerde-DEOKSİRİBOZ bulunur. • Deoksiribozun ribozdan farkı C-2’ pozisyonunda OH grubu olmamasıdır.

7. Nükleik Asit Kimyası • Nükleozit- baz + şeker • NMP = nükleozit + 1 PO4 • NDP = nükleozit +2 PO4 • NTP = nükleozit + 3 PO4 • Nükleik asitlerin yapı taşıdır • özel NTPs: ATP & GTP

8. Nükleotitlerde Bağlanma • Nükleotid yapısındaki bağlar son derece özgüldür. • Şekerin C-1’ atomu azotlu bazla kimyasal bağ yapar. • Pürinlerde N-9, • pirimidin ise N-1 atomu şekerin C-1’ atomu ile bağ yapar. • Nükleotidlerde fosfat grubu, şekerin C-2’, C-3’ yada C-5’ atomu ile bağ kurar. • Bu yapı, biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DNA ve RNA’da bulunandır.

9. Polinükleotitler • İki mononükletit arasında bağ yapısında, iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır oluşan bağ fosfodiester bağıdır, çünkü fosforik asit her iki taraftaki alkol grubu ( iki şekerdeki OH grubu ) ile ester bağı yapar. Aynı bağ, RNA da da bulunur. • dinukleotitler & trinükleotitler • oligonükleotitler (<20) • polinükleotitler (>20) • Uzun polinükleotid zincirleri varyasyon sağlamaktadır. • 1000 nt oluşan bir zincir 41000 kombinasyon ile oluşturulabilir. • Levene’nin tetranükleotid hipotezi bu varyasyonu sağlamamaktadır.

10. Fosfodiester bağları DNA ve RNA’nın kovalent iskeletidir

11. DNA Yapısının Aydınlatılması • 1940-1953 Erwin Chargaff, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Linus Pauling, Francis Crick, James Watson arasında yarış 1953 yılında Nature- “The Double Helix” yayını ile sona ermiştir. Watson- Crick için yapıyı aydınlatmadaki en önemli kaynaklar • Hidrolize edilmiş DNA’nın baz kompozisyon analizleri • DNA’nın X ışını kırınımı çalışmalarıdır.

12. 1950’lerin başında iki deney hattının bulguları DNA’nın yapısına ilişkin ipuçlarını ortaya çıkarmıştır. • Avusturya kökenli Amerikalı biyokimyacı Erwin Chargaff birçok türdeki DNA’nın eşit miktarda adenin (A) ve timin (T) ve eşit miktarda guanin (G) ve sitozin (C) bazları içerdiğini göstermiştir. • Daha sonra İngiliz fizikçi Maurice Wilkins ve İngiliz kimyacı Rosalind Franklin X-ışını difraksiyon tekniğini kullanarak DNA’yı X-ışınları ile bombalamışlar ve sonra da X-ışınlarının kırılma ve yansımalarına göre molekülün yapısı hakkında fikir sahibi olmuşlardır.

13. Rosalind Franklin, Watson ve Crick’in DNA yapısını ortaya çıkarmalarında hayati öneme sahip bulgular elde etmiştir. Franklin, DNA’nın iyi çalışılmış kuru kristal “A” formunu ve hücrelerde görülen “B” formu olarak adlandırılan ıslak tipini birbirinden ayırt etmiştir. • Mayıs 1952’de çektiği B formunun “51 no’lu fotoğrafı” elde edebilmek için 100 saat uğraşmıştır. • Fotoğraftaki belirgin simetri Franklin’e molekülün kusursuz sarmal yapısında olduğunu ve fosfatların pozisyonunu göstermiştir. • Franklin uzun zamandan beri DNA’nın genetik materyal için aday olduğunu düşünmektedir.1939’daki kolej günlerinde tuttuğu lab defterinde bir nükleik asit şeklini yanına “Kalıtıma geometrik temel?” şeklinde not düşmüştür. • 1953’ün başında tüm yapının ortaya çıkarılmasına çok yaklaşmıştır. 30 Ocakta Wilkins, Watson’a Franklin’in 51 no’lu fotoğrafını göstermiştir.

14. Yarış sürmektedir. • Şubat boyunca ünlü biyokimyacı Linus Pauling DNA için üçlü sarmal yapı önermiştir. Bu sırada Watson ve Crick 51 nolu fotoğraf nedeniyle şeker fosfat iskeletinden emindirler ve dikkatlerini bazlar üzerine çevirmişlerdir. • İronik olarak evreka anı sofistike kimya ya da kristalografi ile uğraşırken değil de cardboard kırpıntıları (kesik parçalar) ile uğraşırken gelmiştir. • 28 Şubat cumartesi sabahı Watson, Crick ile toplantısına erken gelmiştir. Beklerken dört DNA bazının kesilmiş parçaları ile oynayıp A’yı A ile daha sonra G ile eşleştirmekle meşgul olmuştur. A’yı T’nin G’yi de C’nin yanına getirdiğinde benzer yapılar görmüş ve aniden bütün parçalar yerine oturmuştur. Crick 40 dakika sonra geldiğinde ikili bulmacayı çözdüklerini anlamıştır. • Sonunda Watson, Crick ve Wilkins Nobel ödülü’nü kazanmıştır. • 1958’de Franklin 37 yaşında yumurtalık (ovarian) kanserinden öldüğü için Nobel ödülünü alamamıştır. Çünkü Nobel sadece yaşayan kişilere verilmektedir.

15. 1949-1953 Erwin Chargaff ve ark. Baz Kompozisyonu Çalışmaları

16. Chargaff kuralı • Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde adenin miktarının timine, guanin miktarının da sitozine daima eşit olduğunun saptanmasıdır. • Yani Chargaff kuralı‘na göre doğal DNA moleküllerinde adeninin timine veya guaninin sitozine oranı daima 1’e eşittir. (A/T=1 ve G/C=1) • Pürinler= pirimidinler(A+G=T+C) • İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler.

17. X-Işını Kırınımı • DNA zincirleri X-ışını bombardımanına tutulur ve molekülün atomik yapısına göre saçtığı ışınlar belirlenir. Buna göre; • 1947- William Astbury DNA’da 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA’nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri sürmüştür. • 1950-1953- Rosalind Franklin 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA’nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu daha saf örnekler kullanara gösterebilmiştir.

21. DNA’daki baz eşleşmesi modelin genetik açıdan en önemli özelliğidir. Bu yerleşim nedeniyle eksen boyunca büyük ve küçük oluklar ortaya çıkar. • Sağ el sarmalının uzaydaki konformasyonu, Watson Crick’in verilerine en uygun olanıdır.

23. DNA çifte sarmalında zincirler birbirlerinin tamamlayıcısıdır.

24. DNA molekülü kendini oluşturan nukleotidlerin sayısına bağlı olarak, büyüklüğü türden türe değişen, uzun zincir şeklinde bir yapı gösterir. İnsanda bu zincirin uzunluğu açıldığında 2 metreye kadar varabilir. Bütün halinde eldesi zincirin hassas ve kırılgan yapısından ötürü çok güçtür. • Nukleotidlerin yapısı bazik olmasına karşın oımurgadaki PO4(fosforik asit) grubunun varlığı polinükleotid zincirlerin asit özellikte olmalarına yol açar ve nükleik asit terimi de bu özellikten kaynaklanır. • DNA çift sarmalının dikkate değer ve önemli bir özelliği, molekülü oluşturan zincirlerin birbirlerinden kolaylıkla ayrılabilmesi ve yeniden birleşebilmesidir. Protein sentezi ve DNA replikasyonu (kendi kopyasını oluşturması) bu özellik sayesinde meydana gelebilir. • DNA’nın iki zinciri, birbirine sadece H bağları ve hidrofobik etkileşimlerle bağlı olmaları nedeni ile, nükleotidleri arasındaki kovalent bağlardaki herhangi bir kopma olmaksızın çözülebilir (denatürasyon). Aynı şekilde çözülmüş molekülün zincirleri tamamlayıcı bazları arasında H bağlarının oluşumu ile birleşip sarmal yapıyı yeniden oluşturabilir (renatürasyon).

25. DNA’nın formları • Tek-krista-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A’luk çözünürlük 1 A’a kadar düşürülmüştür. • A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å)—yüksek tuz kons. Yada dehidrasyon koşullarında baskındır. • B-DNA right handed (normal, 10 baz/tdönüş, çap 20 Å) • C-DNA right handed (dehydrated, 9.3 bases/turn,19Å) • D-DNA right handed (no guanine, 8 bases/turn) • E-DNA right handed (no guanine, 7.5 bases/turn) • Z-DNA left handed (all GC, 12 bases/turn, 18 Å) • P-DNA DNA yapay şekilde uzatılırsa bu formu alır, fosfat grupları iç kısımdaazotlu bazlar sarmalın dış yüzünde • why should we care? • Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur. • A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur. • Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının regulasyonunda rol alabilir.

26. Farklı DNA formlarının özellikleri

27. Farklı DNA formları

28. DNA-RNA • Double stranded - single stranded • RNA’da T yerine U bulunur.Tipleri • mRNA, rRNA, tRNA • snRNA (RNA processing) • Telomerase RNA (replikasyon) • antisense RNA (regulasyon)

29. U.V ışığının soğurulması (254-260 nm arasında en fazla) Çökelme Davranışı- Nükleik asitler çeşitli gradiyent santrifügasyon işlemleri ile ayrılabilirler. Çökelme özelliği molekülün yoğunluğu, kütlesi ve biçimine bağlıdır ve Svedberg katsayısı (S) olarak ölçülür. DNA ve RNA Araştırmalarında Kullanılan Analitik Yöntemler

30. Nükleik asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu • DNA’nın denatürasyonu sonucu H-bağları kopa, çift zincir çözülür ancak kovalent bağlar kırılmaz. • Isı yada kimyasal yolla olabilir. • Denatürasyon sırasında DNA akışkanlığı azalır, U.V absorbsiyonu ve denge yoğunluğu artar. • Isı sonucu oluşan denatürasyona erime-melting denir • Isıtılan DNA’nın U.V absorbsiyonundaki artışa hiperkromik kayma denir. • Erime sırasında, DNA’nın 260 nmdeki absorbsiyonu sıcaklığa karşı grafiklenirse br erime profili elde edilir. Bu eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir. DNA zincirinin %50’sinin açıldığı sıcaklıktır.

31. DNA’nın ısı ile denatürasyonu

32. DNA’nın denatürasyonu

33. Kısmen denatüre DNA

34. DNA hibridizasyonu • DNA çifte sarmalı ve RNA denatüre olabilir. • Anneal: Denatüre segmentin tekrar çifte sarmal oluşturması • Farklı türlerin nükleik asidleri hibrid formlar oluşturabilirler. Türler ne kadar yakınsa hibridizasyon o kadar kolay gerçekleşir. • Nükleotidler ve nükleik asidler non enzimatik transformasyona uğrarlar.

35. Kromozom Yapısı ve DNA Organizasyonu

36. İnsan genomu ≈ 3 x 109 bp • İnsan diploidtir, her çekirdek 6 x 109 bp yada ≈ 2 m DNA içerir • 5-10 mm çapındaki çekirdeğe nasıl sığmaktadır?

37. DNA molekülünün büyüklüğünün hücrenin boyutları ile kıyaslanması

38. DNA’nın Kromozomlarda Paketlenmesi • Kromozomlar içerdikleri DNA moleküllerinden çok daha kısadırlar. Bu nedenle DNA’nın kromozomlara paketlenmesi için hayli organize bir paketleme sistemi gereklidir. Ökaryotlarda DNA kromatin şeklnde düzenlenmiştir. • DNA paketlenmesi ile ilgili ilk veriler 1970’lerde biyokimyasal analizler ve EM çalışmalarından elde edilmiştir. • İlk bilgiler DNA’nın DNA-binding proteinler olarak da bilinen histonlar ile ilişkili olduğu idi. Ancak ayrıntılı yapı billinmiyordu. • 1973-74 yıllarnda birkaç araştırma grubu kromatinler (DNA-histon kompleksi) üzerinde nüklease protection assay’i yapmışlardır. DNA-histon kompleksi enzimlerle muamale edildiğinde DNA sadece histon proteinlerinin yer almadığı bölgelerden kesilmiştir. Yaklaşık 200 bç uzunluğunda pekçok fragment oluşmuştur. Bu gözlem enzimatik parçalanmanın gelişigüzel olmadığını göstermiştir.

39. DNA’nın Kromozomlarda Paketlenmesi • Kromozomlar içerdikleri DNA moleküllerinden çok daha kısadırlar. Bu nedenle DNA’nın kromozomlara paketlenmesi için hayli organize bir paketleme sistemi gereklidir. • İnterfaz sırasında, genetik madde ve ilgili proteinler açılırlar ve nükleusun içinde kromatin olarak dağılırlar. Mitoz başladığında kromatin yoğunlaşır ve pofaz sırasında bilinen tipik kromozomlar şeklini alır. Bu yoğunlaşma, her birkromozom ipliğinin boyunun 10.000 kez kısalmasını sağlar. • DNA paketlenmesi ile ilgili ilk veriler 1970’lerde biyokimyasal analizler ve EM çalışmalarından elde edilmiştir. • İlk bilgiler DNA’nın DNA-binding proteinler olarak da bilinen histonlar ile ilişkili olduğu idi. Ancak ayrıntılı yapı billinmiyordu. • 1973-74 yıllarnda birkaç araştırma grubu kromatinler (DNA-histon kompleksi) üzerinde nüklease protection assay’i yapmışlardır. DNA-histon kompleksi enzimlerle muamale edildiğinde DNA sadece histon proteinlerinin yer almadığı bölgelerden kesilmiştir. Yaklaşık 200 bç uzunluğunda pekçok fragment oluşmuştur. Bu gözlem enzimatik parçalanmanın gelişigüzel olmadığını göstermiştir.

41. Ada ve Donald Olins, taneciklerin kromatin zinciri ekseni boyunca düzenli olarak yerleştiğini ve bir zincir üzerindeki boncukları andırdığını söylemişlerdir. (v-body, nu, nükleozomlar) • Nükleozom-DNA etkileşimi çalışmaları; H2A, H2B, H3 ve H4 histonlarının (H2A)2, (H2B)2, (H3)2 ve (H4)2 şeklinde iki tip tetramer oluşturduğunu göstermiştir. • Nükleozom yapısındaki 4 protein: H2A, H2B, H3, ve H4 • H3 ve H4 are arjinice zengin, yüksek oranda korunmuş • H2A ve H2B lizince daha zengin • Arjinin ve lizin histidin, histon proteinlerinin bazik ve pozitif yüklüolmasına neden olur. • Kornberg- tekrarlayan herbir nükleozomda bu iki tetramerden birer tane olduğunu yaklaşık 200 bç lik DNA ile birleştiğini iler sürmüştür. • Nükleaz ile parçalama işlemi biraz kısa tutulursa, 200 bç lik DNA’dan bir kısmı nükleozomdan ayrılır ve 196 bç içeren Nükleozom kor Partikülü elde edilir. Bu sayı çalışılan tüm organizmlarda aynıdır. • 1984- Finch ve Klug X ışını analizleri ile detaylı nükleozom yapısı-196 bç lik çekirdek DNA, nükleozom başına 1.7 dönüş yapacak şekilde histon oktamerinin etrafını sola doğru süper sarmal yaparak sarar.

42. Histonlar küçük bazik proteinlerdir

43. NÜKLEOZOM YAPISINDAKİ BEŞİNCİ PROTEİN, H1 • H1, nükleozomun bir parçasıdır anck oktomerin dışında gibi görülür • H1 organizmalar ve dokular arasında farklılıklar gösterir. Ausio J

44. Nükleozom protein çekirdeği

45. 2nm çapındaki DNA11 nm çapında nükleozom 30 nm kromatin iplikleri (solenoid) oluşturur. • Mitotik kromozom yapısında; sayısız 30 nm solenoidler 300 nm çapında kromatin iplikleri metafaz kromzomundaki kromozom kolları olan kromatidleri oluşturmak üzere kıvrılır700 nm çapında kromatit kardeş kromatitler 1900 nm uzunluğunda kromozom

46. T G A Histone octomer C GC TA Histone proteins GC CG TA AT AT CG 2 nm GC TA Packaging DNA B DNA Helix

47. Histone proteins 2 nm Packaging DNA T G A Histone octomer C GC TA GC CG TA AT AT CG B DNA Helix GC TA

48. 11 nm Histone proteins Nucleosome 2 nm Packaging DNA T G A Histone octomer C GC TA GC CG TA AT AT CG B DNA Helix GC TA

49. Histone H1 GC CG TA AT AT CG GC TA Packaging DNA

50. GC CG TA AT AT CG GC TA DNA Paketlenmesi Histone H1