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SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida

SpHPP. SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida. Manuel Lombardía Uría. Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología. Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida. Fases:. Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés:

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SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida

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Presentation Transcript

  1. SpHPP SINTESIS DE PÉPTIDOS en proteómica dirigida Manuel Lombardía Uría Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología

  2. Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida Fases: • Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés: • proceso esencial para el éxito de los experimentos SRM/MRM • selección basada en criterios empíricos y teóricos • obtención de péptidos proteotípicos óptimos • Síntesis química • Validación experimental de los péptidos : - previa a la síntesis de los péptidos pesados

  3. Selección de péptidos Proteínas de interés

  4. Proteínas asignadas

  5. Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio

  6. Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Selección de péptidos

  7. Criterios de selección de péptidos • Únicos para una proteína particular: Búsqueda en Uniprot/Swiss prot (BLAST) • 3 a 4 péptidos por proteína • No missed cleavages • Longitud entre 6 y 20 aa • Baja hidrofobicidad: valor de 10 a 40 según algoritmo SSRCalc (sequence specific retention calculator) • Evitar aa susceptibles de modificación química • - M y W son fácilmente oxidables • - N seguida de G ó P tiende a desamidarse • - Q y E en N term suelen transformarse en piroglutámico • - C en N term tiende a ciclarse si está carbamidometilada • - N en N term es dificil de liberar durante la síntesis del péptido • - D junto con G, P ó S favorece la rúptura de la cadena a pH bajo • - AA ácido en posición P2 ó P2’ promueven missed cleavage

  8. Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Selección de péptidos Búsqueda de evidencias en BD No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas

  9. Selección de péptidos Proteínas de interés Predicción de PTP Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico” Evidencia experimental Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio Selección de péptidos Búsqueda de evidencias en BD No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas SINTESIS DE PEPTIDOS

  10. Síntesis de péptidos • Aparato: Sintetizador automatizado Multipep de Intavis AG • Método: Síntesis en fase sólida (SPPS) sobre resinas de polímeros mediante química FMOC (grupo protector del amino) • Formatos: placas 96 minicolumnas con filtro con capacidad para 1-10 µmol • Purificación de los péptidos crudos por HPLC semipreparativo • Uso de resinas unidas a Lys ó Arg pesadas (13C y 15N) para péptidos pesados • Cuantificación de péptidos pesados purificados por análisis de aa ó por • espectroscopía fluorescencia (kit comercial)

  11. Validación de péptidos Péptidos sintetizados crudos ó purificados Verificación del péptido por MALDI-TOF MS Validación mediante experimentos LC-MS/MS y SRM/MRM Péptidos proteotípicos óptimos SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS

  12. Péptido 1 crudo Péptido 1 purificado

  13. Péptido 1 crudo Péptido 1 purificado

  14. Péptido 3 crudo Péptido 3 purificado

  15. Péptido 4 crudo Péptido 4 purificado

  16. Péptidos sintetizados

  17. Conclusión Podemos concluir de estos resultados que nuestro método de síntesis es apropiado para la producción de un gran número de péptidos en cantidad y calidad aceptable para su uso en proteómica dirigida.

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