Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10. RAPD, ISSR apod. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

2. RAPD – princip • Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990) • Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s1 arbitrárním primerem • Sekvenci primeru volíme „náhodně“: • obvykle dekanukleotid • počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576 • volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC → stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C) • V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší: • test většího počtu primerů • výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)

3. nic (orientace) nic (moc daleko) RAPD – princip • PCR reakce proběhne, pokud: • jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na protilehlých vláknech DNA • jsou dostatečně blízko u sebe • separace fragmentů elektroforézou na základě délky • jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují

4. http://pgrc3.agr.ca/ RAPD gel • agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální) • barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod. • ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining (minimalizace deformací a posunů proužků) • vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku • dominantní data (0 / 1)

5. kodominantní RAPD – vznik varibility • Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa) většinou detekovatelný jen kratší produkt • Inzerce / delece v amplifikovaném úseku • Inverze apod.

6. RAPD – metodické problémy • Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR • koncentrace a čistota DNA • koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,… • konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno používat stejný cykler • Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C) • mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají zcela přesně (mírně odlišná sekvence) • zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat přesně • zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace

7. RAPD – metodické problémy • Neznámá genetická podstata proužků • nejistá homologie • dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy • až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990) • neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové) • biperentální vs. uniparentální • kompetice primerů apod. • ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru) • mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo • může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,… • nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA • endofytické houby, epifytické řasy,…

8. RAPD - standardizace • vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1) • intenzita proužků se neuvažuje • mohou být heterozygoti, ale nemusí • obecně slabé produkty se neuvažují • raději méně spolehlivých znaků nežvíce, ale nespolehlivých • krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují • zvyšuje se nejistota homologie • podobně i u příliš dlouhých fragmentů • 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp • všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru • všechny vzorky 2× (včetně extrakce!) • uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná

9. Výhody není nutná znalost genomu (univerzální metoda) relativně málo DNA jednoduchost a rychlost cena fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr. RAPD – srovnání s jinými metodami Nevýhody • citlivost na reakční podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD... • dominantní data • nejistá homologie fragmentů atd. • neznámá dědičnost fragmentů

10. nic (orientace) nic (moc daleko) flanking sequence CACACACACACACACACA flanking sequence ISSR • Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994) • podobný princip jako RAPD • jako primery slouží mikrosatelitové sekvence • mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou • amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace

11. ISSR • menší citlivost na reakční podmínky než RAPD • primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD • vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace (menší intenzita mismatched priming) • primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored(„ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA) • anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“) • někdy používán touch-down postup • vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější amplifikace, i když menší výtěžek • v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna předešlými cykly

12. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: • dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V přes noc • post-staining

13. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR 49 T 47 48 25 26 50 52 T 53 T 111 113 T 114 T 123 124 125 131 132 159 160 164 12 13 24 11 112 Carex, Jan Košnar 1st run

14. ISSR - gely • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR 49 T 47 48 12 13 24 25 26 50 52 T 53 T 111 113 T 114 T 123 124 125 131 132 159 160 164 11 112 Carex, Jan Košnar 2nd run

15. ISSR – fragmentační analýza • separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza • fluorescenčně značené primery • pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR • separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru • vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní standard (směs fragmentů DNA o známé délce) • možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou • v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva size standard (LIZ)

16. ISSR – fragmentační analýza Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký

17. ISSR – srovnání s jinými metodami • jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky Výhody • není nutná znalost genomu (univerzální metoda) • relativně málo DNA • jednoduchost a rychlost • cena • fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu • velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr. Nevýhody • dominantní data • nejistá homologie a neznámá dědičnost fragmentů • somatické mutace (nadhodnocují diverzitu) • do jisté míry citlivost na reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů

18. Další podobné metody • DNA amplification fingerprinting (DAF) • velmi krátké primery (5 nukleotidů) • různé teploty annealingu (vysoké i nízké) • Arbitrarily primed PCR (AP-PCR) • delší primery (≥ 20 nukleotidů) • na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace) • Sequence-characterised amplified regions (SCAR) • osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování) • specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům • primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní varianty • delší primery = vysoká reprodukovatelnost

19. Další podobné metody • random amplified microsatellite polymorphism (RAMP) • kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru • složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –střídání v různých cyklech) • ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) → produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět • … a mnoho dalších metod využívajících jako primery: • specifické sekvence různých typů transpozonů • kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů • kombinace s restrikčním štěpením fragmentů

20. ISSR - aplikace • populační genetika (diverzita, fragmentace,…) • ochranářská • invazní • klonální a prostorová struktura populací • hybridizace • rozmnožovací systémy • taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…) • (fylogeografie) • (mezidruhové vztahy, fylogeneze)

21. www.primulaworld.com Populační a ochranářská genetika Crema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36 • Primula apennina, endemit • 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů • relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač) • souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci) • tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi • potvrzeno i Mante-lovým testem(mírná pozitivní korelace)

22. Taxonomie Jiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158 • Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko • spousta „podezřelých“ endemických druhů • 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence • PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS) • 3 výrazné skupiny v PCoA • nesoulad s morfologií • některé druhy nelze rozlišit • podpořeno také ITS • návrh revize taxonomie (spojení některých druhů)

23. Hybridizace Ducarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405 • Rhinanthus minor, R. angustifolius • test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8 druhově specifických lokusů (4 pro každý druh) • hybridní index: čisté druhy -4 a 4, F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi • 2 přírodní populace + 1 umělá • vznik hybridů v umělé populaci • většina zpětných kříženců k Rh. angustifoliusvysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor • drobné meziroční fluktuace

24. Hybridizace Lo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261 • mangrove rodu Rhizophora, 3 základní druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen) • 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA) • privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů) • STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs)i jeho rodiče • NewHybrids: všechno F1 hybridi • každá lokalita svůj ISSR genotyp →opakovaný vznik hybridů • ITS, cpDNA: ukazuje naobousměrnou hybridizaci jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid

25. Rozmnožovací systémy Han et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20 • Lotos nucifera v Číně • sběr semen (9-20) z 20 rostlin + dospělé rostliny, 10 populací • 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů) • porovnání potomstva a mateřský r.v programu MLTR • velká míra cizoprášení (>90%) • skoro žádný inbreeding (f ~ 0) • mírná autokorelace (podobné zdroje pylu u blízkých mateřských rostlin) + obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)

26. Identifikace klonů Gross et al. 2012, Ann. Bot. 109: 331–342 • Klonální struktura sterilních i fertilních popu-lací Greivillea rhizomatosa (Proteaceae) • Simpsonův index, gene diversity, modelypříbuznosti jedinců • 4 ISSR primery / 120 lokusů • velká klonální diverzita (>90%) i u sterilních populací (→ minulost) • somatické mutace ! 10 ze 42 ramet spojených pod zemí mělojiný genotyp • podle modelů 17-48% genotypů(v různých populacích) mohlo vzniknout somat. mutacemi [pozor, jiný druh]

27. Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie) Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390 • Tripodion tetraphyllum (= Anthyllistetraphylla) v sev. Africe • sucho, včetně intenzivních pastvin • 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každésemena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94) • 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak) • zřetelně klesající variabilita od západu k východu • 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ, plynulý přechod (klinální variabilita) • relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie) • zřetelné autokorelace na škále <400 km • asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu na V okraji gradientu

28. Prostorová struktura populace Matesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848 • společná populace Thymus vulgaris (hojný)+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2 • prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…) • genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh) • obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi • u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii79 genotypů ze 100) • korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris