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Intérêt de la PCRq en CGH array

Intérêt de la PCRq en CGH array. Dr Nathalie LE DÛ Laboratoire de cytogénétique GH Cochin – St Vincent de Paul PARIS. XXIème colloque ATC - Rouen – 22/23 Sept 2011. Quelles anomalies peut-on « voir », avec quelle technique cytogénétique ?. Notion de «  résolution  »

Leo
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Intérêt de la PCRq en CGH array

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  1. Intérêt de la PCRq en CGH array Dr Nathalie LE DÛ Laboratoire de cytogénétique GH Cochin – St Vincent de Paul PARIS XXIème colloque ATC - Rouen – 22/23 Sept 2011

  2. Quelles anomalies peut-on « voir », avec quelle technique cytogénétique ? • Notion de « résolution » • Caryotype standard: 10 – 20 Mb • Caryotype en « haute résolution »: 5 Mb • FISH: 150 kb (BAC) à 50 kb (cosmide) • CGH array: • Puce BAC: 500 kb à 1 Mb • Puce oligos: 100 kb (sur tout le génome) • voire moins pour certains types de puces (< 1 kb) • PCRq: amplicon = 90 à 150 pb  Techniques de plus en plus fines pour explorer le génome

  3. Principe de la PCR • Technique d'amplification enzymatique qui permet, à partir d'un fragment d’ADN, d'obtenir plusieurs millions de copies identiques de ce même fragment • En PCR classique, l’amplification d’une séquence d’ADN suit 3 étapes: - dénaturation de l’ADN double-brin - hybridation des amorces - synthèse du brin complémentaire (ADN polymérase) Au fil des cycles, la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. Dans la pratique, une PCR de 30 cycles produit environ 106 copies. Le produit amplifié est détecté lorsque les cycles de PCR sont terminés. • Un des avantages majeurs de la PCR quantitative est de pouvoir quantifier le nombre de copies d’ADN initialement présentes dans le prélèvement. détection du produit amplifié au cours de la réaction (détection rendue possible en ajoutant une molécule fluorescente au mélange réactionnel)  PCR « en temps réel » Le Thermocycler mesure une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié à chaque cycle.

  4. PCR classique versus PCR en temps réel

  5. Cinétique de la PCRq Phase exponentielle d’amplification = phase la plus reproductible de la réaction, seul moment où la PCR est modélisable donc QUANTIFIABLE

  6. Modes de détection • Plusieurs types de détection du produit PCR: - grâce à une molécule se liant à l’ADN (SYBRGreen®) - grâce à une sonde moléculaire spécifique (Taqman®,…)

  7. Chimie SybrGreen (1) Fluorochrome s’intercalant spécifiquement dans l’ADN double brin nouvellement synthétisé. Sous une excitation UV, émission d’un signal de fluorescence dont la mesure permet de quantifier l’ADN double brin.

  8. Chimie SybrGreen (2)

  9. Chimie TaqMan Sonde marquée par 2 fluorophores: - extrêmité 5’ de la sonde = fluorophore donneur ou émetteur - extrêmité 3’ = fluorophore extincteur ou quencher Le quencher étant à proximité du donneur inhibe l’émission de fluorescence par ce dernier. Lorsque la sonde est hydrolysée par la Taq polymérase, le fluorophore et le quencher s’éloignent entrainant une émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de cible hydrolysée.

  10. Seuil Notion de cycle seuil (Ct) • Pour quantifier un échantillon par PCR en temps réel, on détermine le nombre de cycles à partir duquel le produit PCR est détectable • Le moment d’apparition de ce signal seuil dénommé cycle seuil ou Ct (Cycle threshold) est dépendant de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon amplifié

  11. Quantification (1) Plusieurs façons de quantifier l’ADN: - quantification absolue dilutions standards de concentrations connues puis détermination de la concentration absolue du gène cible

  12. Quantification (2) • quantification relativefait intervenir un gène de ménage (GAPDH, Albumine, beta-actine, …) qui va servir de normalisateur (considéré comme stable dans le modèle présenté) et ne subira pas de changement d’expression en fonction des conditions analysées. Ce gène de contrôle va permettre de compenser d’éventuels biais de PCR provenant de : - variations dans la quantité et la qualité des échantillons - rendement d’extraction différent entre échantillons - variations dans les erreurs de pipetage - variations d’efficacité de PCR  le gène de référence est quantifié en même temps que le gène cible étudié. La concentration de ce dernier est ensuite normalisée par rapport à celle connue du gène de référence

  13. Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen® Avantages: • Spécifique • Quantitatif • Reproductible • Peu coûteuse • « Rapide » … Limites: Absence de spécificité de la fluorescence mesurée +++ 1 - risque de détection de dimères d’oligonucléotides  Choix judicieux des primers en amont pour assurer la spécificité 2 - ou d’un produit PCR non spécifique  contrôle de la présence d’un seul produit PCR par évaluation du Tm du produit PCR à l’aide de la courbe de fusion

  14. Etapes de vérification en PCRq • Recherche de primers dans la région: • Vérifier l’absence de variants (Ensembl, UCSC) • Cibler plusieurs exons d’un même gène ou plusieurs gènes de la région (UCSC) • Faire un BLAST pour rechercher les homologies sur d’autres chromosomes et les « masquer » • Rechercher les snp et les masquer • Rechercher les séquences répétées • Obtention d’une séquence « épurée » • Choix des primers (attention: dimères) • Réalisation des courbes standards avec les primers choisis, calcul d’efficacité de PCR • Réalisation de la PCR quantitative pour le patient • Interprétation du dosage - Confirmation ou infirmation de l’anomalie suspectée en CGH array - Analyse des parents: Polymorphisme (CNV) ? Duplication pathogène ? • Etude du mécanisme de survenue par Hybridation in situ

  15. Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen® Les dimères • HAIRPIN: replie d’un primer sur lui-même • CROSS DIMER: intéraction intermoléculaire entre le primer Forward et le primer Reverse quand ils présentent des homologies (F-R ou R-F) • SELF DIMER: intéraction intermoléculaire entre primers du même sens (F-F ou R-R)

  16. Avantages/Inconvénients de la chimie SybrGreen®Courbes de fusion (= de dissociation) Pour vérifier qu’un seul produit PCR a été amplifié, on réalise une courbe de fusion en fin de réaction.Réalisée en soumettant les amplicons à une température progressant de 55°C à 95°C et en mesurant l'intensité de fluorescence en continu. Tm (température de fusion) = température à laquelle 50% des brins sont désappariés (spécifique)

  17. Interprétation des courbes de fusion Tm1 Tm2 épaulement traduisant la présence d’un second produit PCR minoritaire Un seul pic  même Tm pour toutes les amplifications PCR SPECIFIQUE PCR NON SPECIFIQUE

  18. Résultats Les résultats sont exprimés par un rapport cible/référence de chaque échantillon normalisé par le rapport cible/référence d’un échantillon appelé calibrateur. La précision du résultat dépend des efficacités de PCR des gènes cibles et référence. L’efficacité de PCR est un facteur important pour la reproductibilité des résultats. Plus l’efficacité PCR est grande, plus la PCR sera robuste, en particulier lorsque l’on travaille avec des échantillons présentant un faible nombre de copies. Ratio = 1.5  duplication Ratio = 0.5  délétion

  19. Pourquoi choisir la chimie SybrGreen ? De façon idéale, chimie TaqMan: mieux ++ • plus spécifique • Pas de dimères • Mais coûteux • Et design des amorces/sonde long Choix de la chimie SybrGreen: • Moins coûteux • Design moins long mais à recommencer à chaque vérification de CGH … • Pb des dimères  Choix stratégique et financier …

  20. Arrêt investigation cytogénétique ou dup ou petite del grande del Arbre décisionnel – Cochin/St Vincent de Paul

  21. Comparaison FISH/PCRq: cas d’une « grande » délétion 22q11.2 Caryotype standard FISH 22q11.2/22q13.3 (délétion 22q11.2 non visible) délétion visible sur mitoses et sur noyaux

  22. Comparaison FISH/PCRq: cas d’une « grande » délétion 22q11.2 Conclusion: Grande délétion vue en FISH et en PCRq

  23. Comparaison FISH/PCRq: cas d’une duplication 22q11.2 22q11.2/22q13.3 duplication non visible sur la quasi totalité des mitoses, visible sur quelques noyaux mais … 3 spots 2 spots duplication 22q11.2 non visible asymétrie de signal sur certaines mitoses, non visible sur de nombreux noyaux Conclusion ??

  24. Comparaison FISH/PCRq: cas d’une duplication 22q11.2 Conclusion: duplication 22q11.2 vue en PCRq, douteuse en FISH + étude simultanée des parents (de novo )

  25. Quid du conseil génétique ? • CGH, PCRq: aucun renseignement sur le mécanisme • Importance de la FISH ++ • Implication d’un 3ème chromosome dans 1.5 à10% des cas de duplications (selon les publications) Recurrence, submicroscopic complexity, and potential clinical relevance of copy gains detected by array CGH that are shown to be unbalanced insertions by FISH. Neill NJ, Ballif BC, Lamb AN, Parikh S, Ravnan JB, Schultz RA, Torchia BS, Rosenfeld JA, Shaffer LG. Genome Res. 2011 Apr;21(4):535-44 « the potential for an otherwise benign duplication to result in a clinically relevant outcome through the disruption of a gene necessitates the use of FISH to determine whether copy-number gains detected by array CGH represent tandem duplications or unbalanced insertions »

  26. Exemple Duplication 9p12 en CGHa Duplication confirmée par la PCRq (ratio 1.5, 3 copies) Hypothèse 1 = duplication en tandem ? Hypothèse 2 = insertion dans un 3ème chromosome ?

  27. FISH Insertion de matériel chromosomique 9p12-p21 dans le bras court du chromosome 5 = Hypothèse 2 Demander les parents De novo Hérité d’un des 2 parents (insertion équilibrée) Conseil génétique ++ (trisomie 9p, monosomie 9p) PCRq et FISH = techniques COMPLEMENTAIRES ++

  28. En pratique …

  29. CAS 1 • Enfant M. Lilou, 2 ans • Clinique: crises épilepsie, dilatation ventriculaire, gesticulation excessive, hypotonie axiale • Cytogénétique: • Caryotype: normal 46,XX • Etude subtélomères: normale • CGH array: suspicion de délétion en Xp22.13 (40 kb) emportant le début du gène CDKL5 • 23 exons, 2 isoformes • Exprimé dans le cerveau fœtal humain (isoforme II) • Impliqué dans la survenue de l’encéphalopathie épileptique infantile • Mutations ++ • translocations X-autosome interrompant le gène CDKL5, microdélétions, …

  30. Interprétation CGH Logiciel Genoglyphix Logiciel Signal Map

  31. PCRq Choix des primers dans le gène CDKL5, exon 1 Confirmation de la délétion en Xp22.13 FISH: Région trop petite (40 kb), pas de BAC Etude des parents en PCRq: caractère hérité ou de novo ?

  32. CAS 2 CGH array: dup Xq11.1 (411 kb) PCRq: primers choisis dans le gène ZC4H2 Confirmation de la duplication Xq11.1 Patient Mère Père T. CGH T. fille Etude des parents en PCRq: Dup origine maternelle

  33. RP11-90I7 Duplication Xq11.1 mat vue en PCRq mais pas en FISH (411 kb) RP11-90I7 Sur métaphases: pas de duplication (RP11-90I7) Sur noyaux: pas de duplication (RP11-90I7)

  34. Patient Mère Père Témoin fille CAS 3 CGH array: dup Xp22.33 (636 kb) • PCRq: choix des primers dans • le gène CRLF2 (PAR2) Confirmation de la duplication Xp22.33 origine maternelle

  35. RP11-892B14 RP11-892B14 Dup Xp22.33 mat vue en PCRq mais pas en FISH (636 kb) sur métaphases: pas de duplication (RP11-892B14) Sur noyaux: pas de duplication (RP11-892B14)

  36. Patient Témoin CGH Témoin labo CAS 4 CGH array: dup 16q23.1 (522 kb) PCRq: primers choisis dans le gène NUD7 Confirmation de la duplication 16q23.1

  37. RP11-24I3 RP11-24I3 RP11-24I3 sur métaphases: asymétrie de signal (RP11-24I3) ? Sur noyaux: duplication dans 60% des noyaux Dup 16q23.1 vue en PCRq et FISH (noyaux ++)

  38. Témoin Patient Père Mère CAS 5 CGH array: del 3q13.31 (430 kb) PCRq: primers choisis dans le gène ZBTB20 Confirmation de la délétion 3q13.31 Etude des parents en PCRq: del 3q13.31 de novo

  39. RP11-107J18 RP11-107J18 Sur noyaux: pas de délétion (RP11-107J18 sur métaphases: pas de délétion (RP11-107J18 Délétion 3q13.31 dn vue en PCRq mais pas en FISH (430 kb)

  40. Conclusion Complémentarité des techniques: • CGH array: dépistage • PCRq: vérification, quantification • FISH: étude du mécanisme chromosomique  Pb de la détection des mosaiques (seuil ?) Confrontation des expériences: • autres techniques de vérification • labos « FISH exclusive »

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