Pátráme po mikrobech Díl IX. Průkaz nukleové kyseliny

1. Pátráme po mikrobechDíl IX.Průkaz nukleové kyseliny Ondřej Zahradníček K praktickému cvičení pro VLLM0421c zahradnicek@fnusa.cz

2. Obsah této prezentace Úvod – pohádka Metody detekce nukleové kyseliny Princip PCR PCR prakticky Kontrolní otázky

3. Pohádka • Když Lipold, syn rolníka z Křídlovic, zemřel léta Páně 1184, jeho smrt provázela spousta dohadů. Byly to opravdu souchotiny, na co umřel? Mezi lidem se říkalo, že jeho bratr Děpold mu záviděl, že jeho díl pole je lepší a má lepší přístup ke slunci. • Teprve za více než osm století se ukáže pravda: Lipoldovou smrtí opravdu nebyl vinen Děpold, ale Mycobacterium tuberculosis

4. Poučení z naší pohádky • Průkaz nukleové kyseliny je velmi citlivá a přesná metoda – někdy tak citlivá, že se její citlivost musí uměle omezit, aby nebyly zachyceny náhodné komponenty • Zajímavostí je, že mikrobiální DNA lze zachytit i v kosterních pozůstatcích stovky let starých • Tyto metody používáme zejména tam, kde jiné přímé metody jsou obtížně proveditelné či málo spolehlivé

5. Metody detekce nukleové kyseliny

6. Použití metod průkazu DNA (RNA) vklinické mikrobiologii • Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný • Typickým příkladem je M. tuberculosis • Nehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné ubikvitárně. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí • Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí,ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní

7. Důležité upozornění • Nehodláme studenty učit principiální otázky týkající se molekulárních metod.K tomu jsou určeny jiné předměty • Naším cílem jeseznámit studenty s přehledem využitelnosti těchto metod v lékařské mikrobiologii. • Jedince s hlubším zájmem o tuto problematiku ve 3.–5. ročníku rád přivítá as. Filip Růžička ve volitelném předmětu VSMB081

8. Průkaz nukleové kyseliny • Metody bez amplifikace (genetické sondy). Jsou méně citlivé, to je někdy i výhoda • Polymerázová řetězová reakce (PCR) velmi citlivá, stačí i jedna molekula DNA. Lze ovšem uměle citlivost snížit. Za PCR vděčíme Dr. K. Mullisovi, který obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za objev PCR. • Ligázová řetězová reakce (LCR)je velmi podobná (ale zavedla ji jiná firma) • Průkaz virové RNA je možný pomocí upravené PCR

9. Další členění PCR ve smyslu různých cílových molekul amplifikace • specifické PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.) • „multiplex PCR“ (několik specifických cílových míst v jedné reakci) • univerzální (cílové místo = gen, který mají všechny bakterie – např. 16S rRNA)

10. DNA čip (DNA microarray) je kolekce spotů ("skvrnek") mikroskopických vláken DNA na destičce (skleněné, silikonové). DNA čipy se používají ve výzkumu k měření úrovně exprese u velkého počtu genů (104, i 106) simultánně nebo ke genotypové analýze více oblastí genomu Každý spot obsahuje několik molekul jednoho konkrétního DNA oligonukleotidu (próby, reportery). Vzorek se přivede do kontaktu se spotem. Nyní molekuly vzorku (nazývané cílové) hybridizují s komplementárními molekulami přichycenými na destičce. Produkty hybridizace jsou detekovány pomocí cílů označených fluoroforem (či jinak). Výsledky bývají zpracoványbioinformatickými postupy. Obdobou DNA čipů jsou RNA čipy a proteinové čipy. DNA mikroarray ("mikročip")

11. DNA microarray http://dnaandgenome.blogspot.com/2010/09/dna-microarray.html

12. Real-time PCR • Též nazývána kvantitativní polymerázová řetězová reakce (Q-PCR/qRT-PCR) • Kvantita může být vyjádřena jako absolutní množství kopií či jako relativní počet • Je založena na principu klasické PCR, avšak amplifikovaná DNA je detekována tak, jak reakce pokračuje ve skutečném čase. • Dvě nejčastější metody, používané k detekci produktu při RT-PCR: • nespecifická fluorescenční barviva, která se vážou na jakoukoli dvouvláknovou DNA • DNA sondy sekvenčně specifické (oligonukleotidy označené fluorescenčním reporterem, který umožňuje detekci pouze v případě hybridizace sondy skomplementárním cílem DNA)

13. Detekce fluorescence u RT-PCR http://www.lfhk.cuni.cz/farmakol/interakce/micuda/real-PCR.htm

14. LCR rusky  molbiol.edu.ru/review

15. Princip PCR

16. Základní schéma reakce PCR • V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý. • V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru • Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace • Gelovou elektroforézou nebo • Metodou ELISA (≠ serologická ELISA k průkazu mikrobiálních antigenů nebo protilátek!!!) • Použitím fluorescenční sondy • Jinak

17. Izolace DNA • Izolace DNA je proces, který musí předcházet vlastní PCR. Zahrnuje rozbití buněk a odstranění nadbytečných součástí přítomných ve vzorku. Amplifikace specifických úseků DNA metodou PCR • Je to jádro vlastní reakce PCR. Využívá se Taq polymerázy.

18. Postup izolace DNA pro PCR

19. PCR a teplota Vývoj PCR byl umožněn výzkumem vedoucím k objevení Taq polymerázy z termofilní bakterie Thermus aquaticus, která umí přežít vysoké teploty.

20. PCR proces toxics.usgs.gov www.pcrstation.com/images

21. Termocyklery kinich.cifn.unam.mx http:///images/110.jpg

22. PCR prakticky

23. Proč je důležitá interní kontrola • Velmi běžným jevem je, že dochází k.tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) • Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce • Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). To ale nevadí, je-li viditelný pozitivní výsledek reakce, nemůže jít o inhibici

24. Možné výsledky PCR Následující možnosti platí bez ohledu na způsob detekce (gelovou elektroforézou nebo ELISou) • Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být. • Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce • Vzorek i IC negativní = inhibice reakce

25. Přehled interpretace

26. Detekce výsledků PCR pomocí gelové elektroforézy • Gelová elektroforéza je jednou z.možností detekce produktu PCR • Produkty putují gelem od katody směrem k anodě a jsou zviditelněny pomocí UV-transluminátoru • Každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC) • Kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko

27. Příklad gelu (www.medmicro.info)  Vlastní reakce  IC Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder

28. Průkaz produktu PCR metodou ELISA • V praktiku J08 se probírá využití metody ELISA k průkazu antigenů a protilátek • Přístup, používající ELISA k detekci produktu PCR, je však jiný. Nejde tu o sérologické použití této reakce, ale o ELISA-detekci produktu PCR. Proto i zde máme vedle důlku vzorku také důlek patřící IC.

29. RT-PCR • Používá se jiná (fluorescenční) metoda detekce produktu • Průběh reakce je zaznamenáván v reálném čase • Nicméně i zde máme tři typy výsledku reakce: pozitivní/negativní/inhibice Pozitivní Inhibice Negativní Linie vlastní reakce Linie interní kontroly

30. Porovnání výsledků dvou reakcí: průkaz protilátek a PCR • V řadě případů nelze spoléhat jen na výsledek jediné reakce. Pro interpretaci potřebujeme kombinaci výsledků různých reakcí. • V daném případě máme k dispozici výsledek PCR a výsledek reakce ELISA • Musíme mít na paměti, že PCR je přímý průkaz, ELISA k průkazu protilátek je průkaz nepřímý se vším všudy

31. Konec www.roche.com/pages/facets/1/chlamyde.htm.

32. Mycobacterium tuberculosis • Je to původce všech forem tuberkulózy • Zajímavé na tomto mikrobovi je, že žije uvnitř buněk. Jedním z důsledků je i to, že imunita je převážně buněčná a protilátková odpověď je slabá a nejistá. Proto se nepřímá diagnostika v praxi nepoužívá. • Mikroskopie je možná, ale vyžaduje speciální barvicí metodu zahrnující zahřívání (Ziehl-Neelsen, viz praktikum P08) • Kultivace je také možná, ale vyžaduje speciální média a trvá několik týdnů • Proto je PCR dobrým řešením pro diagnostiku. http://www.genomeindia.org

33. Kontrolní otázky Formulace nemusí přesně odpovídat formulaci otázek v IS MU! • 1. Které mikroorganismy je výhodné detekovat pomocí PCR? • 2. Jak zabránit kontaminacím PCR? • 3. Jako lékaři dostanete zprávu z laboratoře: „Výsledek PCR vyšetření na lymeskou borreliózu u pacienta XY: inhibice reakce“. Jak budete takovou zprávu interpretovat? • 4. Petr má čerstvou infekci Lymeskou borreliózou sneurologickými příznaky (trvá asi týden). Jaké budou asi jeho výsledky PCR, ELISA IgM a ELISA IgG? • 5. Jaký je hlavní rozdíl mezi genetickou sondou a PCR? • 6. Jak se nazývá test, který se používá pro paralelní testování exprese většího množství genů? • 7. Co znamená zkratka RT-PCR • 8. Jaký je základní rozdíl mezi klasickou PCR a RT-PCR? • 9. Které metody lze použít k detekci produktu PCR v lékařské mikrobiologii?