KULTURA BILJNIH ĆELIJA I TKIVA IN VITRO

1. KULTURA BILJNIH ĆELIJA I TKIVA IN VITRO

2. In vitro kultura? • In vitro kultura biljnih ćelija, tkiva i organa je posebna grana biotehnologije biljaka kojapredstavlja skup tehnika za aseptično (sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka, biljnihorgana, tkiva i ćelija, u hranljivom medijumu definisanog sastava i pod kontrolisanimuslovima sredine.

3. Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz organizma i gaje na sintetičkoj podlozi. Totipotencija- Sposobnost biljnih ćelija da se in vitro dediferenciraju, dele i da regenerišu pojedine organe,embrione ili celu biljku Plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rasta, razvića i metabolizma, u zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.

4. Postoje različiti tipovi biljnih kultura in vitro. • Prema tipu eksplantata – za pokretanje kulture in vitro se mogu koristiti gotovo svidelovi biljke tj. različiti eksplantati, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena,kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta.

6. Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje,... • Prema toma kakav je rast: organizovan, neorganizovan i mešovit rast

8. Vegetativno razmnožavanje biljaka u kulturi in vitro

9. Gde se vrši vegetativno razmnožavanje biljaka in vitro Laminarna komora Aseptički uslovi kontaminacija

10. Mikropropagacija u užem i širem smislu Sl. Mikropropagacija u užem i širem smislu 1а sakupljanje bočnih I vršnih pupoljaka; 2а – uvođenje pupoljaka ukulturu; 3а rast izdanaka; 4а – multiplikacija izdanaka; 6 – ožiljavanje izdanaka; 7 – adaptacija u staklari. Desno suosnovni koraci razmnožavanja in vitro putem regeneracije izdanka iz kalusa: 1б izolovanje delova listova i stabla kaoprimarnih eksplantata; 2б – uvođenje eksplantata u kulturu; 3б – indukcija kalusa na eksplantatima; 4б – kulturanediferenciranih kalusa; 5б indukcija izdanaka u kalusu; 6 – ožiljavanje izdanaka; 7 – adaptacija u staklari.

11. Organogeneza iz kalusa

12. Organogeneza iz kalusa

13. Izdanak u kulturi Umnožavanje izdanaka Direktna organogeneza

14. Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro • 1. In vitro razmnožavanje mnogo je brže od in vivo razmnožavanja • 2. Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti u in vivo uslovima • 3. Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže od biljaka koje rastu u in vivo uslovima (oslobođene su od patogena i infekcija bakterijama i gljivama) • 4. U in vitro kulturi se razmnožavaju samo zdrave biljke • 5. Vegetativno razmnožavanje u in vitro uslovima može početi sa vrlo malo biljnog materijala kao početnog eksplantata • 6. Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju određenih kultura • 7. Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u ex situ zaštiti ugroženih i retkih biljnih vrsta (npr. Nepeta rtanjensis)

15. Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima in vitro • 1. U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska • 2. Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro • 3. Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako težak i mukotrpan posao • 4. Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva • 5. U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teška

16. Komercijalizacija mikropropagacije 1970s & 1980-tihMurashige 1974 Broad commercial application

17. Organogeneza u najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces obrazovanja jedinki. U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vrši dodavanje određenih komponenti, a najbitnije među komponentama jesu FITOHORMONI. Šta je organogeneza?

18. Skoog i Miller hipoteza • Prekretnica, 1957. balans citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa -Skoog i Miller • Ova hipoteza govori o odnosu koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču na morfogenezu u uslovima in vitro

19. Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadrži veću koncentraciju auksina nego citokinina, pojaviće se korenovi. Ako je koncentracija citokinina veća od koncentracije auksina, pojaviće se pupoljci. Dejstvo citokinina i auksina na organogenezu može se pokazati sledećim primerom. Ako se izoluje deo tkiva stabla duvana i gaji na hranljivoj podlozi koja sadrži potrebne nutritivne sastojke, a od hormona se dodaju auksin (indol-sirćetna kiselina) i citokinin (kinetin) u istim koncentracijama, doći će do deobe ćelija i njihovog uvećavanja. Na ovakvom medijumu stvara se kalus koji se sastoji od mase nediferenciranih ćelija. Dokazi Milerove hipoteze

20. Kod Gloxinie BA 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 (mg/L) NAA 0 0.1 0.3 1.0 3.0

21. Kultura kalusa • Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom se tkivo može održavati unediferenciranom stanju neograničeno dugo. • Kultura kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnogtkiva dediferencijacijom, tako da kalusna tkiva najčešće nisu fotosintetička. • Kalusi se često gaje umraku jer svetlost može podstaći diferencijaciju. • Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa: kompaktne i rastresite.

22. SOMATSKA EMBRIOGENEZA • Somatska embriogeneza je proces u kome haploidne ili diploidne somatske ćelije prolaze kroz karakteristične embrionalne stadijume bez fuzije gameta i mogu stvarati kompletne biljke • Prvi somatski embrioni dobijeni su u kulturi ćelija šargarepe

23. 1. Direktna (neposredna) embriogeneza - embrioni se stvaraju neposredno iz pojedinačnih ćelija, što može smanjiti stepen varijabilnosti u kulturi. Na razvoj ovih embriona utiče sastav hranljive podloge i izbor eksplantata. Direktna somatska embriogeneza

24. 2. Indirektna (posredna) embriogeneza - ovom metodom se prvo stvara kalusno tkivo u kome se kasnije zameću embrioni Indirektna somatska embriogeneza

25. “Prirodna” somatska embriogeneza, kao alternativna strategija reprodukcije biljaka

26. Kultura protoplasta

27. Šta je protoplast • Protoplasti su gole biljne ćelije, bez ćelijskog zida, tako da su zaštićene jedino plazmalemom. • Protoplasti mogu iznova da regenerišu ćelijski zid, da rastu i da se dele • Kultura protoplasta, „ogoljenih“ ćelija bez ćelijskog zida, se može dobiti bilo iz ćelijskesuspenzije, bilo direktno iz mezofila lista. Ćelijski zid se obično uklanja enzimskim tretmanom, dejstvom celulaza i pektinaza u rastvoru visokog osmolariteta.

28. Uklanjanje ćelijskog zida omogućava i fuziju protoplastai dobijanje intra- iliinterspecijskih somatskih hibrida. • Protoplasti su idealan materijal za transformaciju pomoćurazličitih tehnika, kao što su elektroporacija,mikroinjektiranje ili hemijska transformacija • Prebacivanjem protoplasta na čvrst medijum se dobijaju kalusi, iz kojih se mogu regenerisati celebiljke bilo organogenezom, bilo somatskom embriogenezom.

29. Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro • Gajenje in vitrokulturapodrazumeva kontrolu svih relevantnih činilaca (faktora), počev od izboraeksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića ukulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, dokontrole spoljašnjihfaktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura. • Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima, kako nebi došlo do razvoja gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.

30. Rad sa in vitro kulturom podrazumeva i nekeod vidiva sterilizacije kao što su: • 1. Sterilizacija autoklaviranjem (na ovaj način se sterilišu medijumi za gajenje biljaka, kao i posude u kojima se biljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete, petri kutije,...) • 2.Sterilizacija iskuvavanjem ( na ovaj način najčešće se sterilišu instrumenti za rad koji suneophodni pri manipulativnim tehnikama u laminaru) • 3. Sterilizacija biljnog materijala ( koja je još označena i kao dezinfestacija). Za ovusterilizaciju se najčešće koristi razblažena NaClO (varikina ili domestos). • 4. Sterilizacija filtriranjem, gde se pomoću specijalnih filter papira vrši sterilizacija nestabilnihjedinjenja kao što je npr. ABA, GA3, antibiotici ili neki vitamini. Ove komponente se naknadno dodaju uprohlađeni medijum.

31. Autoklav

32. Medijumi za gajenje biljaka mogu biti čvrsti, polučvrsti ili tečni. • Za većinu kultura optimalan pHpodloge je 5.8 ± 0.2. Tečni medijum za razliku od čvrstog ne sadrži agar. Vrlo bitna komponentasvakog medijuma jesu i makro i mikro soli, kao i vitamini. Medijum koji je razliven u erlenmajere

33. Prostor za gajenje biljaka Posebne prostorije sa optimalnim uslovima za gajenje biljaka