PCR - Methoden

1. PCR-Methoden SSP- und SSO-PCR Guido Heymann

2. PCR-SSPSequenzspezifische Primer erkennen einzelne Allele während der Amplifikation PCR-SSOSequenzspezifische Oligonukleotide erkennen einzelne Allele in einem zweiten Schritt nach der Amplifikation vorgegebener DNA-Abschnitte PCR-Methoden

3. PCR-SSP(sequence specific primers) • Genomische oder kodierende DNA eingesetzt • Sense- und Antisenseprimer amplifizieren definiertes Stück DNA • Ein Primer detektiert ein vorgegebenes Allel spezifisch, wenn am 3´-Ende ein Basenmismatch vorhanden ist, findet keine Amplifikation statt • Am Ende der Amplifikation ist eine direkte Auswertung z.B. über ein Gelbild möglich

4. Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

5. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

6. Prinzip der PCR-SSP Primerannealing mit Basenmismatch 5´ Antisenseprimer 3´ Senseprimer Da Mismatch keine Elongation 3´ 5´

7. Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

8. PCR-SSO(sequenz specific oligonucleotides) • Genomische oder kodierende DNA • Primerpaar amplifiziert größeres DNA-Stück, das spezifische Areale umfaßt. • In einer Detektionsreaktion werden mittels spezifischer DNA-Sonden verschiedene Allele erkannt und in einer zweiten Reaktion dargestellt (Farbumschlag, radioaktiv...)

9. Prinzip der PCR-SSO • Dot-Blot-PCR-SSO: PCR-amplifizierte Ziel-DNA wird auf Trägermedium immo-bilisiert; spezifische Oligonukleotide werden stellenweise aufgetragen; wo spezifische Anlagerung geschah, wird durch Reportermolekül Nachweisreaktion vermittelt.

10. Prinzip der PCR-SSO Reportermolekül mit Antikörper gegen DIG oder Streptavidin radioaktiv oder enzymver- mittelte Farbreaktion Markiertes Oligonukleotid z.B. DIG,Biotin ...... Ziel-DNA Auf Membran fixiert

11. Prinzip der PCR-SSO • Reverse-Dot-Blot-PCR-SSO: Spezifische Oligonukleotide werden auf Trägermedium immobilisiert; PCR-amplifizierte Ziel-DNA, die während der Elongation mit einem Labelmolekül versehen wurde, wird stellenweise aufgetragen; wo spezifische Anlagerung geschah, wird durch Reportermolekül Nachweisreaktion vermittelt.

12. Prinzip der PCR-SSO Strepavidin- konjugiertes Reportermolekül macht Bindung sichtbar (radioaktiv, enzymatisch..) Ziel-DNA wird mit biotinmarkierten Primern amplifiziert und dena- turiert auf die Membran gegeben SSO-Moleküle werden auf Membran immobilisiert (mit Poly-T oder BSA)

13. Prinzip der PCR-SSO • PCR-Oligocapture sandwich assay : Spezifische Oligonukleotide werden an Trägermedium immobilisiert und PCR-amplifizierte Ziel-DNA wird ansatzweise dazugegeben; danach wird ein Oligonukleo-tid, das eine hochkonservierte Region erkennt, dem Ansatz hinzugefügt. Dieses Reporter SSO vermittelt die Nachweis-reaktion.

14. Prinzip der PCR-SSO Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene- diamin, als Farbreaktion umgesetzt Capture Oligo- nukleotid ist an Wand des Reaktions- gefäßes fixiert Detektionsoligo- nukleotid ist mit Enzym gekoppelt, das Substratum- wandlung ver- mittelt PCR-amplifizierte DNA bindet an fixiertes SSO

15. Prinzip der PCR-SSO • PCR-Dual phase Oligocapture assay :In der flüssigen Phase wird die Ziel DNA während der PCR mit Digoxigenin markiert und ansatzweise mit biotinmarkierten SSOs hybridisiert. In der festen Phase wird diese Bindung in streptavidinbeschichteten Reaktionskammern fixiert und über Anti-DIG-Ak als Reaktionsmittler die Bindung dargestellt.

16. Prinzip der PCR-SSO 3 Das Gemisch wird in streptavidin- konjugierte Wells einer Mikrotiter- platte eingefüllt. 5 Es findet eine enzymatische Farbreaktion statt. 4 Das Reportermolekül reagiert mit den an die DNA konjugierten Labelmolekülen. 1 In der vorgeschalteten flüs- sigen Phase wird die Ziel- DNA amplifiziert und mit speziellen Molekülen, z.B. DIG, markiert. 2 Die Ziel DNA wird mit biotinylierten SSO-Sonden hybridisiert.

17. PCR-Fakten • Die tatsächliche Effizienz der PCR liegt üblicherweise bei 70-80%. • Nach etwa 35 Zyklen wird ein Plateau erreicht: • Anstieg der Schmelztemperatur • Reannealing in Konkurrenz zur Primeranlagerung • Abnahme der Primerkonzentration • Hitzestreß auf Taq-Polymerase (T1/2 bei 95°C 40 Min.) • 3´-5´-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase

18. Reaktionsparameter • PCR-Primer: • ab 18 nt Länge ausreichende Spezifität • ab 28-30 nt keine Zunahme der Spezifität • GC-Gehalt zwischen 50-60% • ähnliche Schmelztemperaturen • Poly-T-Reste neigen zu unspezifischen Bindungen • palindromische Bereiche führen zu Haarnadelbildungen • Interprimerkomplementarität erzeugt Dimere

19. Reaktionsparameter • Desoxynukleosidtriphosphate: • pH 7,0 • Taq-Polymerase arbeitet bei niedrigeren dNTP-Konzentrationen genauer • üblich 20-200µM je dNTP

20. Enzymkonzentration • Für 100 µl Ansatz 1 - 2,5 U Enzym • Zu viel Enzym erzeugt Unspezifitäten • Zu wenig Enzym verringert Produkt-ausbeute

21. Andere Einflußfaktoren • Qualität der DNA-Matrize • PCR-Puffer: • Tris-HCL, NH³/KCL... • Magnesiumchlorid • über dNTP-Konzentration, da dNTPs Mg wegen negativer Ladung binden • Auswirkung wie bei Enzymkonzentration

22. PCR-Förderer und -Inhibitoren • Glycerin: erhöht T 1/2 von Taq-Polymerase • DMSO: löst störende Sekundärstrukturen der Matrize auf, hemmt Taq • Heparin: hemmt Taq-Polymerase • EDTA: kann Mg wegfangen • Häm: Fe hemmt Taq • Detergenzien: können PCR hemmen