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Proteasas Parasitarias

Proteasas Parasitarias. Proteasas Definición. Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4) Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas. Enlace Peptídico Características. Plano Rígido

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Proteasas Parasitarias

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Presentation Transcript

  1. Proteasas Parasitarias

  2. ProteasasDefinición • Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4) • Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables • Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas

  3. Enlace PeptídicoCaracterísticas Plano Rígido Polar Restringe conformación de la cadena polipeptídica

  4. El Problema Químico

  5. ProteasasNomenclatura

  6. ProteasasNomenclatura de Schercher y Berger

  7. ProteasasClasificación según mecanismo de acción • Serina proteasas • Cisteína proteasas • Metaloproteasas • Aspártico proteasas • Treonina proteasas • Glutámico proteasas

  8. ProteasasClasificación • Familia: homología significativa a nivel de secuencia de amino ácidos en la porción catalítica. • Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una proteína ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional

  9. Proteasas en los Genomas Eucariotas

  10. Serina proteasasGeneralidades • Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulación XIIa, XIa, IXa, plasmina • Familia Subtilisina, enzimas bacterianas • Tríada catalítica

  11. Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica Tríada Catalítica: His57, Asp102 y Ser195 -Formación de acil intermediario entre el substrato y la Ser Formación de este intermediario covalente se produce a través de un intermediario tetrahédrico de transición cargado negativamente Se cliva el enlace peptítico

  12. Serina ProteasasMecanismo de Acción Catalítica(cont.) Fase de deacilación El intermediario acil-enzima se hidroliza por una molécula de agua liberado el péptido y restaurando el hidroxilo en Ser La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva

  13. Cisteína ProteasasGeneralidades Papaína, catepsinas lisosomales B, H y L Calpaínas citosólicas • Díada catalítica: Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas

  14. Cisteína ProteasasMecanismo de Acción Catalítica La catálisis también se produce a través de la formación de un intermediario covalente e involucra a Cys e His El nucleófilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo El tiolatio se estabiliza por la formación de un par iónico con el imidazol vecino en la His El ataque nuclefílico es en este caso el par iónico tiolato-imidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molécula de H2O2

  15. MetaloproteasasGeneralidades • Amplias differencias en secuencias y estructura • La gran mayoría contienen Zn en sitio activo • Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas Sito activo de la termolisinamostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.

  16. MetaloproteasasMecanismo de Acción El mecanismo catalítico lleva a la formación de un intermediario tetrahédrico no covalente luego del ataque de la molécula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptídico. El intermediario se descompone por la transferencia del protón del ácido glutámico al grupo NH

  17. Aspártico ProteasasGeneralidades • Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina • Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son monoméricas, por lo que la dimerización se requiere para formar la enzima activa • Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo contribuye con un aspartato • El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico proteasas, donde un protón está compartido por los dos aspartatos del sitio activo • El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleofílico

  18. Aspártico ProteasasMecanismo de Acción Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geométrica en la molécula Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo está al rango de pH óptimo de 2-3 La catálisis de las aspártico proteasas no involucra la gneración de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahédrico. El ataque nucleofílico se consigue por 2 transferencias simultáneas de protones: una desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH En términos generales es una catálisis ácido-base.

  19. Inhibidores de ProteasasBajo Peso Molecular • Cisteína: E-64, Leupeptin • Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina • Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina • Aspártico: Pepstatina

  20. Inhibidores de ProteasasInhibidores Naturales • Mas de 100 compuestos naturales identificados • Desde bacterias a animales y plantas • Reversibles o seudo-irreversibles • Impiden acceso al sitio activo • Proteicos, de 50 a 400 aa • Clase específicos excepto familia de α- Macroglobulina • Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas son los mejor caracterizados. Ej. α-1 antitripsina y cistatinas

  21. Metodología de EstudioSubstratos Cromogénicos Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromogénico. La tasa de hidrólisis se mide en Los más utilizados son péptidos 4-nitroanilides pNA) y péptidos thioesteres

  22. Metodología de EstudioSustratos Fluorgénicos Generan un compuesto fluorogénico al producirse el clivaje. La tasa de hidrólisis se cuantifica por medio de un espectrofluorómetro o fluorómetro en forma continua o ensayos puntuales. Los sustratos más usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).

  23. Metodología de EstudioSustratos con Quenching intramolecular En estos substratos, la secuencia peptídica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que actúa como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenómeno se llama transferencia de energía resonante. El clivaje del enlace peptídico lleva a separación del par dador-aceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dador-aceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.

  24. Substratos sintéticosEjemplos • Cathepsin B Bz-Arg-pNA Pyr-Phe-Leu-pNA Z-Arg-Arg-pNA Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA Z-Phe-Arg-MCA • Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA Suc-Phe-Leu-Phe-pNA – • Cathepsin H H-Arg-pNA Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA • Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA • Z-Phe-Arg-AMC

  25. Geles de gelatina-SDS-PAGE CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

  26. SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorogénicos

  27. Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto del Parasitismo • Invasión • Migración • Nutrición • Evasión de la respuesta inmune • Inmunomodulación

  28. Invasión y MigraciónMembranas Basales y Matríz Extracelular

  29. Nutrición • Hemoblobina • Proteínas del suero • Proteínas intracelulares • Proteínas extracelulares (MEC)

  30. Evasión de la Respuesta Inmune • Degradación de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA) • Degradación de componentes del Complemento • Clivaje de moléculas de superificie de células del sistema inmune (Ej. CD4)

  31. Inmunomodulación La cisteína proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresión de la enfermedad

  32. Enfermedad de Chagas • Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi • Parásito heteroxeno • 3 formas: Forma replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector

  33. Proteasas de Trypanosoma cruziCisteína proteasas • Cruzipaína (cruzaína, GP57/51) • Catepsina B-like proteinasas • CAAX Prenyl proteasa

  34. Proteasas de Trypanosoma cruziSerina proteasas • Oligopeptidasa B • Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa) • Serina carboxipeptidasa

  35. Proteasas de Trypanosoma cruziMetaloproteasas • Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.

  36. Cruzipaína Responsable de la actividad cisteína proteasa más promienente de T. Cruzi Se expresa en todos los estadíos parasitarios La mayoría tiene localización lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmática y habría alguna secretada Endoproteasa, digiere proteínas como caseína, SAP, hemoglobina y sustratos sintéticos a pH 7-9. Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofóbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)

  37. Cruzipaína Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en función de AA en P2 Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio también la inhiben Z-Phe-Ala-fluorometilketona E-64

  38. CruzipaínaCorte de subclases de IgG

  39. CruzipaínaCorte de subclases de IgG

  40. CruzipaínaCorte de subclases de IgG

  41. Malaria • Causada por protozoarios apicomplexa del género Plasmodium • 300 millones de infectados, más de un millón de muertes anuales • Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)

  42. Proteasas dePlasmodiumen la Digestión de la Hemoglobina Se desarrolla en la vacuola alimenticia Consume el 75% de la Hb Se producen pequeños péptidos pero no AA por lo que existirían transportadores Las Plasmepsinas I - IV son aspártico proteasas implicadas en la primera fase de la digestión Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas que degradan los polipéptidos grandes generados La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeños péptidos Una aminopeptidasa citosólica completaría el proceso produciendo AA libres

  43. PlasmepsinasNutrición • Degradación inicial de Hb nativa (plasmepsina I) • Clivan enlace Leu203-His204 en región bisagra de cadena α

  44. PlasmepsinasInvasión • Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmática del GR

  45. Amebiasis • Infección intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica • 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales • 2 especies reconocidas • Entamoeba histolytica – patógena • Entamoeba dispar – comensal (10% población mundial)

  46. Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar

  47. Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis

  48. Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de CP • Peptidil diazometanos basados en la secuencias LVG de las cistatinas • , , epoxi ketonas - > potencia que E-64c • Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles • Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM

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