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Proteasas de Fasciola hepatica

Proteasas de Fasciola hepatica. PROTEASAS DE Fasciola hepatica. Fasciola hepatica. Causa la Fasciolosis Afecta rumiantes Zoonosis emergente, varios millones infectados en Bolivia y Perú Produce pérdidas multimillonarias a nivel global. Ciclo biológico de Fasciola hepatica.

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Proteasas de Fasciola hepatica

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  1. Proteasas de Fasciola hepatica PROTEASAS DE Fasciola hepatica

  2. Fasciola hepatica • Causa la Fasciolosis • Afecta rumiantes • Zoonosis emergente, varios millones infectados en Bolivia y Perú • Produce pérdidas multimillonarias a nivel global

  3. Ciclo biológico de Fasciola hepatica

  4. Problemas en el control de la Fasciolosis • Drogas efectivas pero costosas • Animales se reinfectan con facilidad • Tratamiento no evita el daño hepático • Focos de resistencia en Europa

  5. Selección de los productos de excreción/ secreción (E/S) como objeto de estudio • Se pueden obtener en forma relativamente sencilla en cantidades aceptables a partir de gusanos adultos • La fasciola tiene intestino ciego por tanto regurgita el contenido. • Sus componentes entran en contacto con el medio interno del huésped. • Tienen composición menos compleja que el homogeneizado somático

  6. ACTIVIDAD GELATINOLITICA DE LOS PRODUCTOS DE E/S DE FASCIOLA HEPATICA CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

  7. Catepsinas L de Fasciola • Son el 80% de los productos de E/S • Producidas y secretadas por células del tubo digestivo • CL1 de 27,5 kDa es mayoritaria • CL2 de 29 kDa • Se diferencian por actividad sobre péptidos fluorogenicos sintéticos

  8. Actividades de CL1 y CL2 de Fasciola hepatica sobre peptidos fluorogénicos acoplados a AMCKcat/KmM-1.s-1

  9. Actividades in vitro de los PES de Fasciola hepatica sobre IgG1 humana Digestion of IgG1 by Fasciola hepatica E/S products and immunological characterization of the main released products. IgG1l (100 mg) was incubated for 22 h with F. hepatica E/S products(10 mg) at pH 7.3 and 37 C. Proteins were run on 12.5% SDS–PAGEunder nonreducing (left) and reducing conditions (right) and stained with CBB R-250 (lanes 1 through 4) or electrotransferred to nitrocelluelectrotransferred to identify the main digestion products by Western blotting using specific antisera (lanes a through h): Lanes 1 and 4, IgG1l undigested control; lanes 2 and 3, IgG1l 1 E/S products; lanes a and e, anti-L chain; lanes b and f, anti-Fd; lanes c and g, anti-Fcg, lanes d and h, anti-g1 H chain.

  10. Actividades in vitro de las Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre IgGs humanasSitios de corte

  11. Catepsinas L de Fasciola hepatica: Sitios de clivaje de IgGs humanas

  12. Actividades de PES y Catepsinas L de Fasciola hepatica sobre inmunoglobulinas humanas de clase IgGConclusiones • CL1 y CL2 son las principales responsables de la degradación de las subclases de IgG con PES a pH 7.2 a manera de la papaína produciendo los fragmentos Fab y Fc • A pH 5.5 los PES producen la degradación adicional a fragmentos pequeños derivados de la porción Fc • Sólo IgG3 es clivada en ausencia de DTT • Los sitios de corte determinados para CL1 y CL2 no se corresponden con los aa P1 y P2 de los sustratos sintéticos utilizados para determinar la actividad catepsina L (Phe-Arg )

  13. Matriz extracelular y membranas basales

  14. Actividad colagenolítica sobre colágeno fibrilar tipo I

  15. Acividades sobre Fibronectina

  16. Degradación de Laminina

  17. Catepsinas L de Fasciola: Actividad proteolitica sobre componentes de la matriz extraceular y las membranas basalesConclusiones • Colágeno I: es degradado por los PES y en menor medida por CL1 y CL2 en presencia de Cys. • Colageno III: es clivado tanto por PES como por las CLs. • Colágeno IV: degradado completamente por los PES sin Cys, y por CL1 y CL2 en presencia de Cys. • Elastina: No se observa actividad proteolitica. • Laminina: Es cortada por PES, CL1 y CL2. • Fibronectina: Es atacada por PES, CL1 y CL2 produciendo patrones de corte diferentes.

  18. Actividad fibrinogenolítica de CL2: Formación del coágulo

  19. Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados • Conejos infectados con 30MT c/u y sangrados hasta s20 • IgGs purificadas por afinidad • Incubación IgGs con CLs, 20min, relación 10:1

  20. Inhibición de las Catepsinas L de Fasciola hepatica por anticuerpos de conejos infectados y tratados • La actividad gelatinolítica de ambas catepsinas desaparece a las 4-5 semanas postinfección y reaparece 2-4 semanas después del tratamiento con triclabendazol

  21. ENSAYO DE VACUNACION Groups: CL1 CL2 Control Wk0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

  22. ELISA ANALYSIS OF IgG RESPONSES AGAINST CL1 AND CL2 IN SHEEP FROM TRIAL 1 CL2 CL1 A.U. A.U 300 600 500 250 400 200 300 150 200 100 100 50 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Semanas Semanas CONTROL CL1 CL2

  23. Worm burdens and FEC in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1 and CL2 in Trial 1 Group Eggs/g Egg output reducción Flukes % worm Feces (%) recovered reduction CL1 41,8+/-41,2 71 109,1+/-24,6 34 CL2 28,0+/-38 81 107+/-40,1 33 Control 141,8+/-75,6 100 161,4+/-21,4 100

  24. OTRAS PROTEASAS DE FASCIOLA HEPATICA • DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) • LEUCIN AMINOPEPTIDASA (LAP) • CATEPSINA B • LEGUMAINA

  25. DIPEPTIDIL PEPTIDASA (DPP) • Actividad presente en PES de adultos • Clivaje preferncial de Gly-Pro y Lys-Ala • Novel con relación a las DPPs de mamíferos • Aún sin caracterización molecular

  26. LAP de Fasciola hepatica • Metaloproteasa Zn++ dependiente purificada de extracto soluble en deoxicolato • Holoenzima hexamérica formada por subunidades de 67 kDa • Asociada a tubo digestivo • Purificada por columna de afinidad con su inhibidor Bestatina • Trazas en los PES

  27. TRIAL DESIGN Groups: CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP Control Wk0 4 6 20 Inmumization Booster Challenge Necropsy (100 ug antígen in CFA) (100 ug antígeno in IFA) (300 metacercariae)

  28. WESTERN BLOT ANALYSIS OF IgG RESPONSE AGAINST F. HEPATICA PROTEINASES IN SHEEP DURING THE COURSE OF VACCINATION TRIAL Groups: Weeks: Control CL1+CL2 LAP CL1+CL2+LAP LAP CL2 CL1 P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L P L 0 12 0 6 12 0 6 12 0 6 12 P =E/S products L =Leucine aminopeptidase

  29. IgG ANTI-LAP RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 7000 A.U. 6000 5000 CONTROL 4000 LAP CL1-CL2 3000 CL1-CL2-LAP 2000 1000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks

  30. 450 400 CONTROL 350 LAP CL1-CL2 300 CL1-CL2-LAP 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 A.U.

  31. 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Weeks IgG ANTI-CL2 RESPONSE IN GROUPS OF SHEEP VACCINATED AGAINST FASCIOLOSIS IN TRIAL 2 A.U. CONTROL LAP CL1-CL2 CL1-CL2-LAP

  32. Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: CL1-CL2 GROUP: CONTROL Animal No. Flukes recovered Animal No. Flukes recovered 104 56 101 126 110 89 119 59 114 0 122 54 121 0 134 56 125 5 139 65 128 1 Mean 72 135 0 136 0 137 57 Mean 23,1

  33. Worm burdens recovered in sheep vaccinated against F. hepatica with CL1, CL2 and LAP in Trial 2 GROUP: LAP GROUP: CL1-CL2-LAP Animal No Flukes recovered Animal No Flukes recovered 106 0 102 43 107 1 116 0 113 38 120 0 123 0 124 0 130 0 127 30 132 0 138 0 Mean 6,5Mean12,1

  34. Reduction in F. hepatica worm burdens obtained in Trial 2 with CL1, CL2 and LAP Group Reduction (%) LAP 89,6 CL1-CL2 60,1 CL1-CL2-LAP 79,3

  35. OVERVIEW OF VACCINATION TRIALS CONDUCTED IN SHEEP

  36. Ensayos in vitro muestran una correlación positiva entre la capacidad de inhibición de la actividad enzimática por parte de los anticuerpos LAP específicos y los niveles de protección alcanzados

  37. 5´RACE 3´RACE Construcción del producto LAP completo M 3´ 5´ 5 Ciclos Generación de FL 2Kb 1,3 kb PCR 20 Ciclos Amplificación de FL

  38. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GGGGGGGAATTGGCAATGGCGGCGTTGGCTGTGGGCGTGTCTGATCTGTCGGATAAGCGGTTCGACGTTGTTATATTCATCAACGATGATGCCGACGAGGGATGCGCGAAGGATGCGGCCGTGTATGAAGCCTTGAAATCATTCTCCAAA M A A L A V G V S D L S D K R F D V V I F I N D D A D E G C A K D A A V Y E A L K S F S K 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| ATCAATCCTAATTTAGGTAGTGAACTGTCAATTGTTCCGTTTCCTGCCCATCCATCTGGACGACTGATCTACAGTCCAACAGGAGCATTGAACACGGACACGGCGGATATACGCAACGTGTATGATGCTGCTTGCGCTGGAGTCAAACGT I N P N L G S E L S I V P F P A H P S G R L I Y S P T G A L N T D T A D I R N V Y D A A C A G V K R 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 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GCA

  39. FhLAPr Expresión en E.coli pThioHis C M SI I Inducción IPTG 1mM 2hs 37°C Lisados celulares totales

  40. M 1 2 3 4 5 6 7 8 Purificación 500 ml de cultivo Columna quelante Hi Trap (Ni) Binding: 50 mM Tris 01 M NaCl pH 8.3 Elución: 50 mM Imidazol 1 Muestra 2 No retenido 3 Control 4, 5, 6 Eluidos 7 s/ inducir 8 inducido

  41. MODELADO MOLECULAR DE FhLAP

  42. Catabolismo de la hemoglobina GLOBULOS ROJOS HEMOLISIS saposina Hb esófago ENDOPEPTIDASAS ej: catepsina L1 catepsina B catepsina D POLIPEPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego LEGUMAINA EXOPROTEASAS ej: catepsina C, dipeptidilpeptidasa Aminopeptidasa? DIPÉPTIDOS gastrodermis lúmen del ciego

  43. Reactividad cruzada entre FhLAPn y FhLAPr Inmunoblot Suero de oveja inmunizada con FhLAPn Suero de conejo inmunizado con FhLAPr SDS PAGE 12,5% condiciones reducidas

  44. Maldi-Tof de FhLAPn 14 péptidos 192 residuos reconocidos en 523 36,7% de cobertura >FheLAPr MAALAVGVSDLSDKRFDVVIFINDDADEGCAKDAAVYEALKSFSKINPNLGSELSIVPFPAHPSGRLIYSPTGALNTDTADIRNVYDAACAGVKRALSMGCHAPLLYLGSLRSASFGFEWMQRKHLLLNALLGAYHALYLPLEVREMRPTTGLKAQHLGVKEDTKGSDELVLRLAMALEEGRWLARDIGGSDPERMAAPRIVDYLKTSLGGMKGITMSVEKVDIQKYPLMAAVNRAASVVARHDGRVVHLKYEPPNPTEVDTTLYLIGKGITYDTGGADIKANGVMAGMHRDKCGAAAIAGLFKTLGELQPPGLSVSAALAFVRNSVGADSYVADEILVARSGQRIRVGNTDAEGRMVMTDLLCEAKEKAINATNPFLFTIATLTGHVVRAYKHYTAVMDNGPPRIHRVSQSLQEAGDRISDMAEISTVRKEDYEFNRGKTEYEDTLQCNNLPSSATPRGHQIPAAFMALASGLDKHGLGSAKPIPYTHVDVAGSATEIHVLPTAAPLLMFASRYVLPRLGFK

  45. Actividad frente a distintos aminoácidos nmol/min.mg

  46. Leu-AMC Phe-AMC Determinación de parámetros cinéticos

  47. Respuesta humoral de ovinos (ELISA) 0 4 6 10 15 20 25 4 Priming Recuerdo Desafio

  48. Recuperación de parásitos en ensayo de inmunización en conejos Porcentaje de Protección (Control – Inmunizado) x 100 Control 78% Recuperación Grupo Control = 18% Grupo Inmunizado = 4%

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