NOVÉ POSTUPY V MEDICÍNĚ

1. NOVÉ POSTUPY V MEDICÍNĚ Kurz lékařské biologie 190109

2. Nové technologie • Klonování • Kmenové buňky • Genová terapie

3. Kln = výhonek J.Petr 2004

4. KLONOVÁNÍ • Vytvoření jednoho nebo mnoha geneticky identických jedinců využívající jedné somatické buňky mnohobuněčného organismu • Klon je linie geneticky identických jedinců nebo buněk • Klon je organismus geneticky identický s jiným organismem (lidově)

5. Kln = výhonek J.Petr 2004

6. Vegetativní rozmnožování =přírodní klonování             A J.Petr 2004

7. Jednovaječní sourozenci J.Petr 2004

8. Produkce identických dvojčat J.Petr 2004

9. TOTIPOTENCE Schopnost zachovávat potenciál zygoty k vytvoření všech částí dospělého organismu

10. Totipotence u rostlin Diferencované buňky zůstávají totipotentní Schopnost dediferenciace U živočichů se dosahuje genomické ekvivalencepřenosem jader somatických buněk do neoplodněných vajíček nebo zygoty Totipotence

11. Jaderné transplantace u živočichů I • 1950s, Briggs, King, Gurdon, žabí model, jádra se diferenciací mění • 1997, Wilmut, Dolly, genomický potenciál somatické buňky lze revertovat • 1998, myš, dodnes 13 savčích druhů • Buňka dospělého savce může zopakovat svůj vývoj od počátku a lze z ní vytvořit nového jedince

13. Přenos jader Enukleace oocytu Přenos somatické buňky pod zonu cytoplastu J.Petr 2004

14. Jaderné transplantace u živočichů II • Malá úspěšnost, důvodem může být nesprávná metylace embryonální DNA • Syndrom náhlého úmrtí dospělých klonů, poruchy imunity, nadváha, deformace vnitřních orgánů, defekty placenty • Klonování u primátů se nedaří, Makak rhesus, proteiny mitotického vřeténka (2000) • Genetické a epigenetické faktory, imprinting genů

15. Defekty J.Petr 2004

17. REPRODUKČNÍ Výsledkem je narození nového jedince LÉČEBNÉ Výsledkem jsou embryonální kmenové buňky, použité v budoucnu k léčbě např. chorob srdce, mozku i genetických chorob, organismus je nevnímá jako cizí Klonování

18. Léčebné klonování • Lidské reprodukční klonování je neetické, ale může přinést prospěch • Jak učinit léčebné klonování bezpečným? • Neúspěch u makaka, nutné stadium blastocysty • Fúze ESC s normálními buňkami, riziko nádorového onemocnění

19. Terapeutické klonování Pacient Potřebuje srdeční svalovinu Odběr buněk pokožky J.Petr 2004

20. Oocyt Pokožka J.Petr 2004

21. Embryonální kmenové buňky J.Petr 2004

22. Diferenciace Diferenciace ESC Langerhansovy ostrůvky Srdeční sval Sval kosterní chrupavka Pacient J.Petr 2004

23. Soumrak klonování lidí?(Nature Rewiew Genetics) Ian Wilmut: „Na současném stupni poznání jsou neodpovědným hazardem i pokusy s klonováním pro léčebné účely. “ Josef Fulka ml.: „Pokusů bylo provedeno žalostně málo.“

24. Klonování pomocí přenosu somatických jader je neefektivní Dokud nebudeme znát hlavní faktory, které je vymezují, jsou snahy o klonování u lidí vědecky naivní a naprosto neodpovědné

25. Pluripotentní kmenové buňky Éra biologie kmenových buněk

26. Kmenové buňky jsou jediné buňky, které si zachovaly schopnost sebeobnovy a diferenciace v alespoň jeden, často však v mnoho buněčných typů.

27. Kmenové buňkyvlastnosti a příklady • Přítomny v mnoha tkáních savců, • Zajišťují tkáňový repair a homeostázi, • Spermatogoniální kmenové buňky jsou unipotentní, tvoří spermatozoa, • Hematopoetické kmenové buňky jsou pluripotentní, tvoří erytrocyty a všechny typy bílých krvinek, • Pluripotentní kmenové buňky dávají teoreticky vzniknout všem buněčným typům savčího organismu a jsou odvozeny z embryonálních tkání.

28. Pluripotentní kmenové buňky • V kultuře se mohou neomezeně množit • Zachovávají stejný karyotyp • Jsou schopné vytvořit jakýkoliv buněčný typ v lidském těle • Představují obrovský opravný zdroj nemocných nebo poškozených tkání • Důležité pro poznání vývoje embryonálního, fetálního a postnatálního

32. Typy embryonálních savčích pluripotentních kmenových buněk • Embryonální karcinomové buňky ECC • Embryonální kmenové buňky ESC • Embryonální zárodečné buňky EGC (primordial germ cells PGC, prvopohlavní buňky)

33. Jaká je skutečnost? • Jaké jsou vlastnosti pluripotentních kmenových buněk (PSC)? • Jak blízko jsme k použití PSC v klinice?

34. Původ a vlastnosti PSC • První linie z teratokarcinomů (ECC) • ESC jsou odvozeny z vnitřní buněčné masy (ICM) z preimplantovaných embryí ve stadiu blastocysty • EGC jsou odvozeny z prekursorů gametických buněk • Markery PSC (Oct4)

35. Kultivace PSC • PSC se dělí symetricky, je známo doposud malo faktorů odpovědných za sebeobnovu PSC • Kultivace na vrstvě fibroblastů (živná vrstva - feeder layer), diferenciaci-inhibující aktivita (DIA) faktoru LIF (cytokin) • K izolaci kromě LIF nutný i ligand Kit a bFGF

37. Multipotentní kmenové buňky • Počet derivátů je snížen • Není třeba embryonální zdroj a jeho zničení • „Dospělé“ kmenové buňky (orgánové kmenové buňky)

38. Kmenové buňky v klinice • Úspěchy na živočišných modelech • Terapie pomocí buněk u člověka • Kultivace ve velkém množství • Zatím málo použitelných linií • Optimalizace kultivačních podmínek, pomoc genomiky

39. Bezpečnost terapie pomocí buněk • 3 klíčové aspekty: • Histokompatibilita • Vedlejší nádorové onemocnění • Asociace s infekčními agens v kultivačních mediích

40. Úvod do genové terapie Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro pacienta

41. Reparace genů in situ - terapie genů Ektopická reparace – terapie geny GT somatická GT germinální 2 x 2 základní strategie

42. GENOVÁ TERAPIE IN VIVO (IN SITU) Genetický materiál je přenášen přímo do buněk pacienta GENOVÁ TERAPIE EX VIVO Buňky jsou odebrány z těla pacienta Genetická manipulace je provedena in vitro Buňky jsou transplantovány zpět do těla pacienta Přenos genetického materiálu(genů, genových segmentů, oligonukleotidů

43. Typy nemocí vhodných ke genové terapii • Infekční choroby(virový nebo bakteriální patogen) • Nádorová onemocnění(poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a opravných genů) • Genetická onemocnění(genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu) • Poruchy imunitního systému(alergie, záněty a autoimunní choroby)

44. KLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE Optimální exprese vloženého genu Tvorba chybějícího produktu Přímá likvidace nemocných buněk Aktivace imunitního systému NEKLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE Inhibice exprese patogenního genu Restaurace normální exprese siRNA Strategie genové terapie

45. Podmínky zdařilé GT • Ve správném čase, místě, množství a se stálým výsledkem EMIR(EST MODUS IN REBUS) • Opravovaný gen nesmí být dominantní • Vysoká účinnost genového přenosu • Stálá integrace a exprese • Verifikace na savčích modelech • Bezpečnost manipulací, interference se zárodečnými buňkami • Jen u vážných onemocnění • Etické posouzení protokolů

46. Transfer genů do buněk I • Savčí virové vektory: • Retrovirové vektory • Adenovirové vektory • Vektory viru herpes simplex • Vektory adenoasociovaného viru

47. Retrovirus Replikace/integrace Signál obalování 5LTR y Gag Pol Env 3LTR Obalové proteiny Proteiny core

48. Retrovirový vektor Exprese genu Signál obalování 5LTR y Marker Promotor Cizorodý gen 3LTR Opravný gen Identifikace/separace

49. Transfer genů do buněk II Nevirový přenos: • Endocytóza mediovaná receptory • Lipozómy • Přímé injikování nebo bombardování částicemi