Análise de Canais para Na + Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal

1. Universidade de São PauloInstituto de Ciências BiomédicasDepto. de Fisiologia e BiofísicaDoutorado em Fisiologia Humana Análise de Canais para Na+Ativados por Voltagem em Neurônios do Gânglio da Raiz Dorsal João Luis Carvalho de Souza – aluno de doutorado Antônio Carlos Cassola – orientador Setembro de 2006 São Paulo – Brasil

2. Potencial de ação +30 mV 0 Kv Nav voltagem (mV) Kir/Twik Kir/Twik Kv -70 1 0 tempo (ms)

3. Superfamília de CanaisAtivados por Voltagem

4. Nav 1.1 Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.4 Nav 1.5 Nav 1.6 Nav 1.6 Nav 1.7 Nav 1.5 Nav 1.8 Nav 1.8 Nav 1.9 Nav 1.9 75 80 85 90 95 100 Nomenclatura e Genealogia dos canais para Na+ % de identidade na seqüência de aminoácidos

5. 6 TM 2 TM Kv Kcsa Estrutura terciária de canais iônicos Doyle et al, 1998

6. Filtro de seletividade em solução no filtro Doyle et al, 1998

7. Estrutura terciária de canais iônicos ativados por voltagem Kv1.2 MacKinnon et al, 2005

8. Kcsa Ativação e inativação doscanais para Na+

9. Farmacologia dos Nav

10. Farmacologia dos Nav Bloqueio do poro

11. Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por efeito alostérico Sítios em segmentos transmembrana batrachotoxin, ciguatoxin

12. Farmacologia dos Nav Alteram a dependência de voltagem por estabilizar segmentos transmembrana Sítios em alças extracelulares a-scorpion toxins sea-anemone toxins spider toxins b-scorpion toxins

13. Farmacologia dos Nav Anestésicos locais

14. Expressão de canais para Na+ ativados por voltagem em células de mamíferos

15. Expressão de canais para Na+ em mamíferos Neurônios Células não neuronais

16. TTX-S TTX-R 75 80 85 90 95 100 Canais para Na+ em gânglio da raiz dorsal (GRD) Nav 1.1 Nav 1.2 Nav 1.3 Nav 1.7 Nav 1.4 Nav 1.6 Nav 1.5 Nav 1.8 Nav 1.9 % de identidade

17. fixa Registro de correntes de Na+ ativadas por voltagem pela técnica de “voltage clamp” Im = Vm Gm x

18. Fixação de voltagem“Voltage clamping” tradicional Vm i Vc célula 10mm

19. Rf Vc Rf Cm Ic Ra Ip Im Icp Cp Rm Vc Fixação de voltagem“Voltage clamping” / “Patch Clamping” Hamill et al, 1981

20. 20 Im (nA) 15 10 5 Vm (mV) 40 -80 -60 -40 -20 20 60 80 100 -5 -10 -15 -20 INav = (Vm-Vr) x GNav -25 ENa= +41,5 mV INa+ ativadas por voltagem +80 mV -110 mV Vr 5 nA 5 ms 0 Extracelular - banho NaCl 50 mM Cloreto de colina 82 CaCl2 1,8 CoCl2 1 KCl 4 Hepes 10 Glicose 5 pH 7,4 (NaOH) Sol. Intracelular - pipeta NaCl 10 mM CsF 150 TEA 10 EGTA 9 Hepes 10 ATP 2 pH 7,4 (CsOH)

21. Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicas

22. Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasRELAÇÃO I-V 10 Ipico (nA) 8 6 4 2 Vm (mV) 0 -80 -60 -40 -20 20 40 60 -2 -4 -6 -8 -10

23. Duas equações de Ohm-Boltzmann são necessárias para se ajustar à relação IV

24. LV conductance 60 HV conductance Gaussian fitting of data 50 40 30 number of cells 20 10 0 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 5 V1/2 classes (mV) 10 Componente 1 8 Componente 2 INa - pico (nA) 6 soma 4 2 0 -90 -70 -50 -30 -10 10 30 50 -2 Vm (mV) -4 -6 -8 -10 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasRELAÇÃO I-V 10 Ipico (nA) 8 6 4 2 Vm (mV) 0 -80 -60 -40 -20 20 40 60 -2 n=200 -4 -6 -8 -10

25. 0 mV -5 mV -110 mV -160 mV 0 dado 1 equação 2 nA 1 ms Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasINATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA -15000 -10000 Pico de corrente (pA) -5000 0 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 Vpré-pulso (mV)

26. Duas equação de Boltzmann são necessárias para se ajustar à curva de inativação estacionária

27. dado 1 equação 2 equações total componente 1 componente 2 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasINATIVAÇÃO ESTACIONÁRIA -15000 -10000 Pico de corrente (pA) -5000 0 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 Vpré-pulso (mV)

28. 0 mV 0 -110 mV 1 nA 1 ms 20 nS 5 ms Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasCINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO dado 1 equação Hodgkin and Huxley, 1952c

29. Duas equações do modelo de Hodgkin e Huxley são necessários para se ajustar à curva de ativação e inativação da condutância no tempo

30. dado 1 equação 2 equações 1,2 componente 1 1 componente 2 total 0,8 0,6 fração de condutância 0,4 0,2 0 -5 5 15 25 35 tempo (ms) 20 nS 5 ms Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasCINÉTICAS E ATIVAÇÃO E INATIVAÇÃO

31. 1 nA 0 mV 20 ms -110 mV 0 Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasCINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO 1,0 0,8 0,6 fração de corrente recuperada da inativação 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 intervalo entre pulsos (ms)

32. Duas exponenciais são necessárias para se ajustar à cinética de recuperação da inativação das condutâncias ativadas por voltagem

33. dado 1 equação 2 equações CONTROLE 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 fração recuperada da 0,5 inativação 0,4 EXP1 0,3 0,2 EXP2 0,1 SOMA 0,0 0 20 40 60 80 100 120 tempo Neurônios do GRD expressam canais para Na+ com diferentes propriedades biofísicasCINÉTICA DE RECUPERAÇÃO DA INATIVAÇÃO 1,0 0,8 0,6 fração de corrente recuperada da inativação 0,4 0,2 0,0 0 20 40 60 80 100 120 intervalo entre pulsos (ms)

34. Conclusões Neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos neonatos expressam populações de canais para Na+ ativados por voltagem com diferentes propriedades biofísicas. Métodos biofísicos de análise são úteis em distingüir as duas populações de canais.

35. Agradecimentos Prof. Dr. Antônio Carlos Cassola

36. FIM

37. f(x) 5 4 3 2 1 x 0 -5 -4 -3 -2 -1 f(x) = mx + b m= 0 1,3 b= -1,3 2 f(x) = 1,3x – 1,3