CERCETAREA MEDICALA IN EPOCA GENOMICII SI PROTEOMICII

1. CERCETAREA MEDICALA IN EPOCA GENOMICII SI PROTEOMICII

2. GENOMICA • Genomica este stiinta care se ocupa cu studiul genomului organismelor. • Genomul este intreaga informatie ereditara a unui organism. Este codificata fie in ADN fie in ARN pentru unele tipuri de virusuri. Genomul include atat genele cat si secventele non codificatoare ale ADN-ului • In timp ce genomica ofera oportunitatea de a corela raspunsul unui organism cu factorii stresanti din mediul (din punct de vedere al modificarii expresiei genelor), intelegerea efectului unor astfel de evenimente asupra organismului uman este departe de a fi indeplinita. • Acest domeniu include eforturi intensive de a determina intreaga secventa a ADN-ului organismelor si mapping-ul genetic in detaliu.

3. Human Genome Project • 2001, initierea Human Genome Project • 2007 a fost declarata incheiata secventierea genomului uman estimata la aprox 20.000-25.000 gene. (cu mai putin de o eroare la 20,000 baze). • Afisarea rezultatelor proiectului necesita resurse bioinformatice semnificative. • Secventa genomului uman poate fi explorata utilizand: • ⇨ NCBI Human Genome Sequencing Progresshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/ • ⇨ University of California (Santa Cruz) http://genome.ucsc.edu/ UCSC Genome Browser • ⇨ Ensembl Genome Browser (Wellcome Trust Sanger Institute & EMBL-EuropeanBioinformatics Institute http://www.ensembl.org/ • ⇨ EMBL-Bank (European Molecular Biology Laboratory's Nucleotide Sequence Database) http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html • .

4. Human Genome Project

5. GENETICA • Investigarea rolului si functiei unei singure gene este scopul principal al biologiei moleculare sau geneticii si este un subiect comun al cercetarii medicale si biologice moderne. • Cercetarea unei singure gene nu intra in cadrul definitiei genomicii, cu exceptia cazului in care scopul analizei acestei informatii genetice si functionale este de a elucida efectul si locul sau in cadrul intregii retele a genomului. • Biologia molecularase ocupa cu intelegerea interactiunilor dintre diferite sisteme ale celulei (inclusiv interactiunile dintre AND, ARN si biosinteza proteinelor) si deasemenea cu intelegerea modului in care aceste interactiuni sunt reglate.

6. Tehnici de biologie moleculara • Izolarea ADN • Verificarea puritatii si determinarea cantitatii de ADN • Reactia de polimerizare in lant (Polymerase chain reaction - PCR) • Electroforeza in gel • Secventierea • Clonarea moleculara si Expresia genelor • Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici: • PCR • Northern Blot • Southern Blot • FISH • Microarray

7. IZOLAREA ADN Etape ale izolarii şi purificarii AND-ului genomic: • 1. Obţinerea sedimentului celular. • 2. Distrugerea peretelui celular: distrugerea peretelui celular se realizeaza prin tratament cu lizozim. • 3. Liza peretelui nuclear. • 4. Deproteinizare enzimatică. • 5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină: proteinele/peptidele sunt precipitate cu soluţie KCl. • 6. Precipitarea acizilor nucleici: precipitarea acizilor nucleici se realizeaza cu alcool izopropilic • 7. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract: In marea majoritate a experimentelor, în vederea îndepărtării moleculelor ARN din extract se efectueaza şi tratament cu RNază A • 8. Este necesară şi parcurgerea unei etape de spălare a sedimentului ADN cu etanol 70% rece. • 9. Resuspendarea sedimentului ADN: Sedimentul ADN este uscat 20 min apoi resuspendat în TE.

8. VERIFICAREA PURITĂŢII SI DETERMINAREA CONCENTRATIEI ADN PRIN ANALIZE SPECTROFOTOMETRICE • Extractele ADN sunt scanate în registrul de lungimi de undă cuprins între 200 nm şi 350 nm. Acest registru a fost ales având în vedere următoarele : • - faptul că moleculele de ADN (atât d.c., cât şi m.c.) prezintă absorbanţă maximă la lungimi de undă ce variază între 257 şi 260 nm (cel mai frecvent, ADN de origine bacteriană prezintă peak-ul specific la λ = 258 nm); • - absorbanţa maximă pentru proteinele rămase eventual în extract este la λ=280 nm;; • - unele polizaharide absorb radiaţiile luminoase cu λ = 230 nm; • - absorbanţa la 220 nm este dată de oligonucleotide ce reprezintă de obicei molecule de ADN fragmentat artificial în timpul tehnicilor de extracţie şi purificare. • Gradul de contaminare proteică a probelor a fost determinat cu ajutorul raportului A260/A280 ; valoarea optimă a acestui raport este cuprinsă între 1.7 şi 2.0, valori mai mici de 1.7 indicând o contaminare proteică semnificativă; valori mai mari de 2.0 sunt, de obicei, corelate cu contaminarea probelor de ADN cu ARN. • Determinarea concentraţiei ADN-ului din probe se face prin analizespectrofotometrice, folosind relaţia : • A260 = 1 corespunde la o concentraţie de 50 μg ADN d.c. / ml

9. T E H N O L O G I A P C R • Reacţia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacţie de Polimerizare în Lanţ) este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvenţe de ADN. • Pe scurt, tehnica PCR permite ca o singura copie a unei secvente de ADN sa fie copiata de milioane de ori sau chiar sa fie modificata pe parcursul amplificarii (atunci cand este dorit acest lucru: ex. Introducerea unei mutatii). Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele 2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare). Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie este o ADN polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază). Principalele 3 etape ale unei reacţii PCR pot fi sintetizate astfel :

11. TIPURI DE PCR • Revers PCR (utilizat pentru amplificarea ARN): denaturarea structurilor secundare ale moleculelor ARN, ataşare un primer complementar capului 3’ al moleculei ARN şi are loc sinteza primei catene de ADNc. In această reacţie se foloseşte o ADN polimerază ARN-dependentă (revers-transcriptază), Hibridul ARN:ADN obţinut în această reacţie de revers-transcriere este supus unei reacţii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, după care la catena ADN rămasă este ataşat un primer complementar cu capul 3’ al acesteia. După sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse într-o reacţie PCR obişnuită. • MS PCR (Mutation Specific PCR): în experimentele de mutageneză situs-specifică, modificările dorite pot fi introduse în ampliconi pe calea primerilor, fie că este vorba de inserţii sau de deleţii. • Obţinerea de sonde ADN/ARN marcate Foarte multe tehnici de obţinere de sonde ADN/ARN folosesc variante de reacţii PCR. Astfel, într-o variantă, se folosesc primeri marcaţi (în sistem radioactiv sau neradioactiv de marcare) şi dNTP nemarcate. Ampliconii obţinuţi într-o asemenea reacţie sunt molecule dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reacţii PCR intră în structura produşilor de reacţie).

12. TIPURI DE PCR • Real Time PCR (PCR cantitativ), • Real Time PCR este o metoda diferita fata de RT-PCR (reverse transcriptase PCR). • Real Time PCR este o metoda care include atat amplificarea fragmentului ADN in timp real cat si analiza acestuia. • Se folosesc cantitati foarte mici de proba. Se pot amplifica atat probe ADN cat si probe ADNc cu aceeasi viteza si eficienta • Un numar mult mai mare de probe de concentratii diferite pot fi analizate in acelasi timp. • Amplificarea fragmentului ADN se poate vizualiza cu ajutorul moleculei reporter pe tot parcursul reactiei, nu la sfarsit.

13. Aplicatii Real-Time PCR • Real-Time PCR poate fi utilizat pentru: • Genotipare • Trisomii si detectarea numarului de gene unice din genom • Genotiparea microdeletiilor • Haplotipare • Analiza cantitativa a microsatelitilor • Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sangele matern • Diagnosticul cancerelor • Cuantificarea expresiei genelor • Masurarea expunerii la radiatii • Studiul ADN mitocondrial • Detectia metilarii • Detectia inactivarii cromosomului X

14. Electroforeza in gel • Este o tehnica utilizata pentru separarea ADN, ARN sau a proteinelor utilizand un curent electric aplicat unei retele alcatuita dintr-un gel pe baza de agaroza. • Este utilizata de obicei pentru analiza, dupa amplificarea ADN prin PCR. • In solutie libera, la pH neutru sau alcalin, acizii nucleici nu pot fi separati. Pentru separarea lor se se folosesc matrici de gel de agaroza sau poliacrilamida. • Un camp electric determina migrarea lor prin gel. Datorita numarului mare de resturi fosfat, acizii nucleici au o puternica incarcatura negativa, migrand in campul electric spre anod • Fragmentele se separa sub forma unor benzi electroforetice • In conditii ideale, viteza de migrare a fragmentelor este direct proportionala cu tensiunea aplicata • Dupa ce separatia este completa, fragmentele ADN avand lungimi diferite sunt adesea vizualizate prin legarea lor de un colorant fluorescent precum bromura de etidiu

15. Electroforeza in gel blanc 58 59.1 60.3 M50 61.4 62.5 63.5 64.5 • Marimea fragmentelor este exprimata in:”nucleotide”, perechi de baze” sau “kb” • pentru o mie de perechi de baze. • Determinarea marimii fragmentelor se face uzual prin compararea cu “DNA-ladders” • ce contin fragmente liniare de ADN, de lungimi cunoscute • Electroforeza acizilor nucleici este o etapa obligatorie in orice protocol de analiza • a acizilor nucleici • Prin ea se realizeaza: separarea fragmentelor ADN rezultate in urma digestiei cu enzime de restrictie; verficarea amplificarii PCR; identificarea si/sau determinarea semicantitativa a fragmentelor ADN rezultate in urma amplificarii PCR; detectia si determinarea semicantitativa a ADN-ului genomic obtinut in urma extractiei din tesuturi

16. SECVENTIEREA • Secventializarea ADN reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat • In momentul de fata s-au dezvoltat tehnici de secventiere automate: fie chimic prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda Sanger • Metoda chimica presupune marcarea ADN-ului supus secventializarii la unul din capetele sale, denaturarea, urmata de de separarea prin electroforeza in gel a celor doua catene • Are loc apoi taierea ADN-ului monocatenar cu obtinerea unor fragmente de ADN cu lungime varibila ce pot fi separate electroforetic pe geluri de poliacrilamida • Metoda enzimatica Sanger consta din replicarea ADN-ului monocatenar incepand de la un punct precis de initiere, replicarea fiind apoi intrerupta in functie de baza existenta in secventa de analizatde catre dideoxinucleotide

18. Clonarea moleculara si Expresia genelor • ADN-ul poate fi manipulat in laborator. • Clonarea moleculară se referă la procedura de izolare a unei anumite secvenţe ADN şi obţinerea mai multor copii ale acesteiain vitro. Clonarea este frecvent folosită pentru amplificarea secvenţelor ADN ce conţin gene, dar poate fi folosită şi pentru amplificarea oricărei secvenţe ADN cum ar fi promotorii, secvenţe necodate şi secvenţe aleatoare ale ADN. • Enzimele de restrictie sunt o clasa speciala de enzime utilizate pentru a taia ADN-ul la un anumit site de restrictie pe care il recunosc, avand ca rezultat fragmente de ADN de lungimi predictibile. Utilizarea enzimelor de restrictie permite ca fragmente de ADN din surse diferite sa fie reconectate si astfel, prin ligarea lor, este obtinut AND-ul recombinat. Adesea asociat cu organismele modificate genetic, ADN-ul recombinat este utilizat in constructia vectorilor care au la baza plasmidele (fragmente scurte de ADN circular).

19. Clonarea moleculara si Expresia genelor • Vectorii de expresie sunt un tip specializat de vectori de clonare in care semnalele pentru translatie si transcriptie necesare pentru controlul genei de interes sunt incluse in vectorul de clonare. Aceste semnle pot fi create artificial pentru a controla mai usor expresia genei de interes. • Expresia genelor este o tehnica de clonare ADN care utilizeaza vectori de clonare pentru a genera o biblioteca de clone, in care fiecare clona exprima o proteina. Biblioteca de expresie este analizata pentru identificarea clonei care intereseaza si aceasta este recuperata pentru investigatii ulterioare. Un exemplu ar fi izolarea unei gene care confera rezistenta la antibiotice. • Scop De obicei scopul final al expresiei genelor este a produce o anumita proteina in cantitate mare.

21. EXPRESIA GENELOR APLICATII Obţinerea insulinei umane. • Noile tehnologii industriale de obţinere a insulinei umane au fost posibile odată cu extragerea genei insulinei (W.Gillbert şi colaboratorii săi, 1980) şi crearea moleculelor recombinate de ADN în baza plasmidelor •  Moleculele recombinate de ADN sunt transferate în Escherichia coli, unde are loc realizarea informaţiei genetice codificate în molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizează şi insulina. Pentru a proteja insulina umană (ea nu este proprie colibacililor şi este distrusă de enzimele bacteriene), în molecula recombinată de ADN se încadrează, pe lângă gena insulinei, şi o genă reglatoare care codifică proteine specifice colibacililor (galactozidaza). Ca rezultat al manifestării informaţiei genetice a moleculei recombinate de ADN, se obţine o catenă polipeptidică hibridă, din care mai apoi se separă insulina. • Datorită utilizării tehnologiei ADN-ului recombinat, se obţin aproximativ 200 grame de insulină de pe 1 m3 de mediu de cultură, adică tot atâta cât se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

22. EXPRESIA GENELOR APLICATII Obţinerea somatotropinei. • Sinteza acestui hormon pe cale artificială s-a început cu producerea de ADNc cu ajutorul revers-transcriptazei, având ca matrice ARNm din hipofize (transcripţie inversă). Acesta a fost clonat, apoi tăiat cu enzime de restricţie pentru obţinerea secvenţei nucleotidice corespunzătoare somatotropinei, cu excepţia fragmentului ce determină primii 23 de aminoacizi. Fragmentul în cauză era clonat separat, ca rezultat al unei sinteze chimice, apoi cele două segmente unite, la ele se adăugă segmente reglatoare şi pe baza plasmidelor se obţine plasmidiul recombinat cu gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat, sintetizau somatotropina (la 1 litru de mediu de cultură se obţine 2,0-2,5 mg somatotropină).

23. TEHNICA MICROARRAY – PRINCIPII GENERALE • Tehnica ADN MICROARRAY – reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii de biologie moleculara si medicina. S-a dezvoltat din metoda de analiza SOUTHERN BLOTTING – fragmente de ADN sunt atasate pe un substrat si sunt hibridizate cu sonde marcate care reprezinta fragmente de gene sau gene integrale • Spoturile pot fi fragmente scurte de gene – SONDE – utilizate la hibridizarea ADNc – TINTA, in conditii foarte bine definite • Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei in fluorescenta a unui fluorofor – marker fluorescent atasat tintei in vederea cuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta • Tehnica ADN microarray poate fi utilizata in: • Detectarea single nucleotide polymorphisms (SNPs) • Detectare ADN (studii de hibridizare genomica comparata) sau ARN (detectat ca ADNc dupa realizarea revers transcrierii) care poate fi sau nu implicat in traducere de proteine • Masurarea nivelului de expresie genica pe baza ADNc poarta denumirea de ANALIZA DE EXPRESIE GENICA

24. Microcipurile microarray traditionale reprezinta o colectie de spoturi ADN microscopice atasate de o suprafata solida – sticla, plastic sau silicon - BIOCIPURI

25. Schema experiment microarray • Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2 probe de ADNc care urmeaza a fi comparate (probe de tesut bolnav / tesut sanatos; celule tratate / celule netratate) marcate cu doi fluorofori diferiti • Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de unda de emisie 570 nm (corespunzator spectrului cu lumina verde), siCy5 cu lungime de unda de emisie 670 nm (corespunzator spectrului cu lumina rosie) • Cele doua tipuri de probe - Cy-labelled cDNA sunt amestecate si hibridizate pe acelasi cip microarray care va fi scanat pentru a analiza intensitatea semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi • Intensitatile relative ale semnalului fluorescent a celor doi markeri pot fi analizate ca raport in vederea identificarii genelor cu expresie stimulata sau inhibata - up-regulated sau down-regulated

26. PROTEOMICA • Proteomica se ocupa cu studiul la scara larga a structurii si functiei proteinelor. • Analiza de secvenţă poate furniza mai multe date decât simpla identificare a proteinei. Prin compararea secvenţei unei proteine cu cele stocate în bazele de date, se pot găsi informaţii despre: structura, interacţiile, activitatea biochimică, evoluţia şi chiar rolul potenţialîntr-o boală. • Structura tridimensională depinde de plierea catenei polipeptidice în spaţiu care reflectă: • Lungimea secvenţei (tip de aminoacizi şi secvenţă) • Structura primară • Modificări post translaţionale suferite de aminoacizi • Funcţia proteinei depinde de structura tridimensională pentru că aceasta specifică forma, distribuţia sarcinilor si poziţia unor aminoacizi cheie. • Proteinele cu secvenţe similare au proprietăţi similare. Paradigma secvenţă similară/ funcţie similară stă la baza bioinformaticii şi ne permite să se facă predicţii structurale şi funcţionale pe baza secvenţei proteice.

27. PROTEOMICA • Gradul de înrudire corespunde nivelului de conservare a funcţiei. Dacă două secvenţe proteice sunt foarte similare, ar putea reprezenta molecule omoloage care au funcţii identice în specii diferite şi care au acumulat mutaţii datorită speciaţiei. Asemenea proteine se numesc ortoloage (de ex. β globina umană şi de şoarece). • Un grad mai scăzut de omologie ar putea indica faptul că proteinele sunt omoloage dar au evoluat divergent în termeni funcţionali. Asemenea proteine se numesc paraloage şi rezultă din duplicaţia genelor şi divergenţa în cadrul genomului. De ex.: mioglobina şi β globina umane.

28. Mioglobina şi βglobina sunt similare, reflectând relaţiile evolutive şi funcţia conservată. Au secvenţe cu 26% identitate şi 39% similitudine. • Teoretic, mii de proteine ipotetice sunt înrudite cu proteine cunoscute, dar secvenţele lor au devenit divergente. Structura lor poate identifica înrudirea. • Cu alte cuvinte, în era postgenomică, datele de baze de secvenţă de proteine, în primul rând conduc la elucidarea funcţiei proteinelor.În evoluţie, structurile proteinelor sunt mult mai bine conservate decât secvenţele. • Scopul proteomicii structurale este de a găsi membrii reprezentativi ai fiecărei familii de conformaţii proteice, de a descifra structura şi a furniza o matriţă pentru compararea acestora. • O aplicaţie directă a proteomicii structurale este proiectarea raţională a medicamentelor. • Nu există întotdeauna o relaţie directă structură-funcţie. Faptul că secvenţe divergente pot adopta aceeaşi structură este folositor pentru identificare relaţiilor evolutive aflate la distanţă. • Totuşi se pot deduce şi relaţii false, pentru că uneori, structuri echivalente din punct de vedere funcţional au evoluat independent.

29. Tehnici de determinare a structurii proteinelor: Nu este încă posibil să se anticipeze structura terţiară a unei proteine numai din datele de secvenţă. Tehnicile majore de studiu sunt: • Cristalografia cu raze X • Spectroscopia RMN Pentru RMN proteinele trebuie să fie solubilizate, să fie stabile şi solubile la concentraţii ridicate şi să nu se agrege sau denatureze în aceste condiţii. • Tehnici de determinare a functiei proteinelor: • Analiza de expresie genica • In cazul analizei ARNm sau a profilului de exprsie genica se monitorizeaza nivelul de expresie a mii de gene SIMULTAN in vederea studierii efectelor anumitor tipuri de tratamente, boli sau analiza genica a diferitelor stadii de dezvoltare a tesuturilor sau a organismelor vii • De exemplu, pe baza analizei microaray se pot identifica genele a caror expresie se modifica ca raspuns la actiunea unui anumit agent patogen sau alt organism, comparand nivelul de expresie din celulele sau tesuturile infectate cu nivelul de expresie din celulele sau tesuturile sanatoase, neinfectate. Microarrays poate fi utilizat pentru a evalua expresia mai multor gene in acelasi timp

30. Valorile nivelului de expresie genica indica cum conditiile experimentale influenteaza nivelul de expresie ARNm a unui grup de gene • Marcarea in verde indica un nivel redus de expresie genica • Analiza de CLUSTER identifica un grup de gene a caror expresie este redusa

31. Aplicatii practice ale proteomicii • Scopul proteomicii structurale este de a găsi membrii reprezentativi ai fiecărei familii de proteine, de a descifra structura, conformaţia şi a furniza o matriţă pentru compararea acestora. • Medicina personalizata, înseamna acordarea unui tratament individualizat pentru pacienti diferiti care au aceeasi boala. Aceasta diferentiere se bazeaza pe particularitatile de ordin genetic, reflectate în compozitia si functionarea proteomului, ale prezumtivului pacient. • Pe timp ce sunt descoperite diferentele genetice dintre indivizi, cercetatorii se asteapta sa fie capabili de a utiliza aceste noi tehnologii pentru a creea medicamente personalizate ce vor fi mult mai eficiente pentru fiecare pacient in parte. • Exemplu: se spera sa se descopere noi medicamente care vor avea drept tinta inactivarea proteazei HIV-1A, o enzima capabila de a cliva o proteina a virusului imunodeficientei umane in parti mult mai mici, active. Virusul nu poate functiona fara formele active ale acesteia: in consecinta ar fi una din cele mai eficiente terapii impotriva HIV

32. Protein databases • UniProt • Protein Information Resource (PIR) • Swiss-Prot • Protein Data Bank (PDB) • National Center for Biotechnology Information (NCBI) • Human Protein Reference Database • Proteopedia The collaborative, 3D encyclopedia of proteins and other molecules.

33. Telomere • In 2009 premiul Nobel pentru Fiziologie si Medicina a fost acordat echipei alcatuite din Elizabeth Blackburn, Carol Greiger şi Jack Szostak pentru descoperirea felului în care cromozomii sunt protejaţi de degradarede catre telomeri şi de enzima telomeraza, în marea parte a regnului animal şi vegetal, de la amibă la om. • Telomerii nu sunt altceva decât extremităţile cromozomilor (în greacă, telos=sfârşit, meros=parte). Sunt secvente de AND repetitiv care se gasesc la capatul unui cromozom

34. Telomere In vederea diviziunii celulare, ADN, purtătorul informaţiei genetice, este copiat cu ajutorul unui sistem replicativ în care un rol important îl are enzima ADN-polimeraza. Aceasta însă nu ştie să copieze telomerii. In consecinţă, s-ar deduce că în urma fiecarei diviziuni celulare, dimensiunile telomerilor se reduc. Insă în cele mai multe cazuri realitatea nu confirmă. Echipa mentionata a identificat motivul -  telomeraza. Enzima ajută ADN polimeraza să producă ADN la nivelul telomerilor pe baza unei matriţe de ARN. Daca celulele se divid fara telomeraza, atunci capetele cromozomilor vor disparea si deasemenea si informatia pe care o contin.

36. Telomerii scurtaţi sunt una dintre cauzele îmbătrânirea, referindu-ne nu numai la cea a celulelor individuale, dar a organismului ca tot unitar. • Pe de altă parte, există boli genetice care au drept caracteristică telomerază deficitară, care implică sinteza unor celule incapabile de a-şi îndeplini funcţia. • Efectele variatiilor in vivo a lungimii telomerelor: • A fost raportat ca persoanele peste 60 ani, ale caror celule sanguine au telomere mai scurte au rate mai mari ale mortalitatii • Telomerele mai scurte au fost asociate cu: • Cresterea de 3,2 ori a mortalitatii prin boli cardio-vasculare • Cresterea de 8,5 ori a mortalitatii prin boli infectioase • O supravietuire in urma tuturor patologiilor global scazuta Cawthon et al, Lancet 361: 393-395, 2003

38. In schimb, dacă activitatea telomerazei este ridicată, lungimea telomerilor este menţinută, senescenţa celulară fiind întârziată. Este cazul celulelor canceroase, care sunt considerate nemuritoare. • Telomeraza este detectata in cantitate mare in 80-90% din formele de cancer invaziv • Nivelul crescut de telomeraza promoveaza fenotipul celular nediferentiat • In plus, telomerele cromozomilor celulelor canceroase sunt mai scurte (dovada a multiple cicluri de replicare), dar nu devin atat de scurte incat sa induca moartea acestora • Daca se introduc mutatii in gena care codifica telomeraza si aceasta devine inactiva: • Este inhibata RAPID cresterea celulelor canceroase • Este redus procesul de metastazare • Aceasta se produce prin: • Downregularea RAPIDA a ciclului celular si a progresiei tumorale • Downregularea metabolismului glucozei • Si (posibil) este indusa diferentierea celulara

39. Din acest motiv, se evaluează în prezent compusi împotriva celulelor cu activitate telomerazică intensă. Rezultatele obtinute pâna acum sunt promitatoare. Deja s-au obtinut o serie de compusi care inhiba activitatea telomerazica la nivelul celulei canceroase, însa se pare ca dozele utilizate sunt destul de mari ceea ce ar putea duce la posibile efecte adverse. • La om: Telomeraza este activa in timpul dezvoltarii fetale si ramane activa in diferite celule proliferative • Celule stem cells • Limfocite, foliculii pilosi, etc • Telomeraza este downregulata, dar inca activa, in multe alte celule de tip adult • Epiteliale • Fibroblasti • Endoteliale

40. CELULELE STEM • Deriva din masa celulara a blastocistului. Pot realiza numeroase diviziuni fara sa se diferentieze. Mentin un set complet de cromozomi • Din ele se pot dezvolta celule ce deriva din toate cele trei foite embrionare. Sunt capabile sa se integreze in toate tesuturile fetale pe parcursul dezvoltarii • Dintr-o singura celula poate rezulta o linie celulara. Pot fi determinate sa prolifereze sau sa se diferentieze. • Le lipseste punctul de control G1. Celulele stem se gasesc de cele mai multe ori in faza S a ciclului celular • Producerea de celule stem pluripotente umane: • Pot deriva din masa celulara a blastocistilor rezultati in urma unor tratamente de fertilizare • Pot deriva din tesut fetal (mai intai s-au folosit celule germinale din tesut fetal de soarece apoi au fost izolate celule germinale umane din tesut fetal de 5-9 saptamani) • Pot fi obtinute pe calea transferului nuclear in celule somatice (cazul oitei Dolly).

41. CELULELE STEM • Importanta celulelor stem embrionare • Descifrarea mecanismelor ce duc la diferentierea celulelor • tratarea unor boli grave cum ar fi cancerul, determinate de cresterea si diferentierea anormala a unor celule • Testarea medicamentelor pe linii celulare • Terapia celulara – tratarea unor boli • Parkinson, • Alzheimar, • boli cardiovasculare, • arsuri, diabet, osteoartrita

42. CELULELE STEM • Clonarea terapeutica implica indepartarea nucleului dintr-un ou si inlocuirea lui cu nucleul subiectului cercetat. • Desi oul se dezvolta folosind ADN-ul donorului de nucleu, creste intr-un blastocit din care rezulta celule stem embrionice cu potential de a deveni celule utilizabile din punct de vedere terapeutic.Celulele, dezvoltandu-se cu ADN-ul donorului, o data implantate in corp nu vor fi atacate de donorul sistemului imun. • Intr-un studiu s-au folosit celule epiteliale din cozile a 24 de soareci cu Parkinson pentru a crea 187 linii de celule, din care au derivat neuroni dopaminici, acestia fiind ajustati la ADN-ul fiecaruia. In continuare celulele ajustate au fost grefate soarecilor cu acelasi ADN. • Un alt grup, de control, a primit celule cu ADN ce nu se potrivea cu ADN-ul propriu. Soarecii ce au primit neuronii dopaminici compatibili cu propriul ADN au prezentat imbunatatiri neurologice si lipsa raspunsului imunologic in timp ce grupul de control nu.

43. CELULELE STEM Expertii au confirmat ca studiul aduce medicina cu un pas mai aproape de un tratament eficace pentru Parkinson. Insa este un drum lung pana la demonstrarea eficacitatii pe oameni, supravegherea soarecilor analizati realizandu-se doar timp de 11 saptamani, ceea ce nu este indeajuns pentru a determina daca tratamentul persista. Fiind primul de acest tip, cercetatorii au demonstrat ca transferul nuclear de celule somatice sau clonarea terapeutica, folosind celule de la un soarece pentru a trata acelasi soarece, poate fi efectuata cu succes.

44. CELULELE STEM • Probleme actuale de rezolvat: • Durata scurta a efectului – in prezent, integrarea genei in genom este de scurta durata, fiind necesare sedinte multiple de terapie • Controlul raspunsului imun – declansat de prima sedinta de terapie,accentuat la repetarea sedintei • Probleme speciale legate de vectorii virali – efecte adverse nedorite(raspuns inflamator, toxicitate, declansarea raspunsului imun, posibilitatea redobandirii virulentei odata incorporat in genomul gazdei) • Bolile multigenice – dificultati in identificarea tuturor genelor implicate, ale tipului de intricare functionala; dificultati in inlocuirea tuturor regiunilor de genom implicate

45. CELULELE STEM • Rezultate semnificative in prezent: • 2008: UCL Institute of Ophthalmology – ameliorarea vederii in urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate • 2007: University of Texas si M. D. Anderson Cancer Center - un studiu pe soareci (combinatie de terapie genica +tehnici nanotehnologice de introducere a genelor) au indus scaderea semnificativa avolumului unor tumori pulmonare • 2006: National Cancer Institute (NCI) – au obtinut limfocite modificate genetic care atacacelule tumorale de melanom malign • 2005: tratata cu succes surditatea datorata distrugerii celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a determinat cresterea de noi celule cohleare • Alte rezultate promitatoare – deocamdata neconfirmate prin studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul Coreei Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozeichistice, anumitor forme de cancer, leucemii, sicklemie etc

46. CELULELE STEM