POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA

1. POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA Institut za javno zdravlje Vojvodine Prof.dr Ivana Hrnjaković Cvjetković

2. 1.DIREKTNO DOKAZIVANJE IZOLACIJOM I IDENTIFIKACIJOM VIRUSA • 1.1 IZOLACIJOM VIRUSA U KULTURI ĆELIJA • 1.2 IZOLACIJOM VIRUSA U EMBRIONISANOM KOKOŠIJEM JAJETU • 1.3 IZOLACIJOM VIRUSA U LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

3. 2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA • 2.1 METODE ZA DOKAZIVANJE VIRUSA ELEKTRONSKA I IMUNOELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • 2.2 TEHNIKE ZA DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSNIH ANTIGENA U UZORCIMA BOLESNIČKOG MATERIJALA TESTOVI FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE (direktni, indirektni i antikomplementarni) ENZIMSKE IMUNOMETODE (direktna sendvič elisa metoda, inhibiciona i kompetitivna) RADIOIMUNE METODE

4. 2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA • 2.3 METODE ZA BRZU I SPECIFIČNU IDENTIFIKACIJU SASTOJAKA VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU Lančana reakcija polimerizacije nuklenskih kiselina (PCR) Tehnike hibridizacije nukleinskih kiselina Elektroforeza ribonukleinske kiseline virusa u poliakrilamid gelu

5. 3.INDIREKTNO DOKAZIVANJE SEROLOŠKE REAKCIJE ZA DOKAZIVANJE SPECIFIČNIH ANTITELA U SERUMIMA • 3.1SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKOG SPECIFITETA Reakcija vezivanja komplementa (RVK) Neutralizacioni test Inhibicija hemaglutinacije Aglutinacija Precipitacija ELISA Testovi fluorescentne mikroskopije Radioimunoesej

6. 3.SEROLOŠKE REAKCIJE ZA DOKAZIVANJE SPECIFIČNIH ANTITELA U SERUMIMA • 3.2 SEROLOŠKE REAKCIJE SLUČAJNOG SPECIFITETA PAUL –BUNELL- DAVIDSOHN-ova PROBA

7. Dokazivanje virusne infekcije • 1.početak infekcije • 2.-4 dokazivanje virusa ,virusnih antigena ili virusne nukleinske kiseline • 5.dokazivanje antivirusnih antitela klase IgM i • 6.dokazivanje antivirusnih antitela klase IgG

8. IZOLACIJA VIRUSA NA KULTURI ĆELIJA

9. ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • U RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI

10. ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • CITOPATOGENI EFEKAT (cpe) SVE MORFOLOŠKE PROMENE KOJE VIRUS IZAZIVA RAZMNOŽAVAJUĆI SE U KULTURI ĆELIJA PROMENE JEDRA, GRANULACIJE U CITOPLAZMI, ZAOKRUGLJIVANJE ĆELIJE, SPAJANJE ĆELIJA I STVARANJE SINCICIJUMA • ĆELIJE KULTURE PROPADAJU ZBOG CITOCIDNOG EFEKTA VIRUSA TAKO NASTAJU DEFEKTI PROZORI U KULTURI ĆELIJA

11. CITOPATOGENI EFEKAT • CMV u fibroblastnim ćelija ,sporo raste, fokusi su mali i diskretni. “sovinog oka” su karakteristične inkluzije u jedru inficiranih ćelija

12. CITOPATOGENI EFEKAT • VZV nukleusi inficiranih ćelija su uvećani i pokazuju eozinofilne intranuklearne inkluzije.Zaokruživanje ćelija i izraziti afinitet za eozin u kasnoj fazi infekcije

13. ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • ZBOG RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA USPORAVA METABOLIZAM ĆELIJE I SMANJENA JE POJAVA KISELE REAKCIJE ŠTO JE DOKAZ DA SE VIRUS RAZMNOŽAVA U ĆELIJI IAKO NE DAJE VIDLJIV CPE • POJAVA V IRUSNE HEMAGLUTINACIJE I HEMADSORBCIJE

14. ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • PRISUSTVO VIRUSA KOJI NE DAJE VIDLJIV CPE MOŽE SE DOKAZATI I INTERFERENCIJOMVIRUS RUBELE NA VERO KULTURI NE DAJE CPE I NJEGOVO SE UMNOŽAVANJE MOŽE DOKAZATI INTERFERENCIJOM SA ECHO VIRUSOM 11 . Ukoliko se virus rubele razmnožava na vero ćelijama inokulisan echo 11 neće moći da se umnoži i da cpe zbog interferencije sa virusom rubele

15. ZNACI RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA KULTURE • U RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI

16. ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • RANA I BRZA DIJAGNOSTIKA • VIRUS SE VIDI BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJA • NIJE MOGUĆA IDENTIFIKACIJA VIRUSA • SKUPA OPREMA I OBUČEN KADAR • ZA VIRUSE KOJI SE NE MOGU UMNOŽAVATI U LABORATORIJI

17. ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • UMESTO SVETLOSNIH ZRAKA SNOP ELEKTRONA KOJI SE PROSTIRU U VAKUMU • UMESTO OPTIČKIH SOČIVA ELEKTROMAGNETNA POLJA • SLIKA SE EMITUJE NA EKRAN ILI SE FOTOGRAFIŠE • UVEĆANJE JE 100 000 PUTA

18. ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • PREPARATI SE PRAVE KAO ULTRATANKI REZOVI TANJI OD 100nm • U CILJU POVEĆANJA KONTRASTA U PREPARATU PREPARAT SE PRSKA POD MALIM UGLOM SUSPENZIJOM KOLOIDNOG ZLATA ČIME SE POSTIŽE PLASTIČAN IZGLED VIRUSA KOJI SU SA JEDNE STRANE OSVETLJENI A SA DRUGE U SENCI POZITIVNO PRIKAZIVANJE

19. ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • OSIM POZITIVNOG PRIKAZIVANJE MOŽE SE VRŠITI I NEGATIVNO PRIKAZIVANJE TRETIRANJEM PREPARATA KALIJUM FOSFOTUNGSTATOM KOJI JE NEPROBOJAN ZA SNOP ELEKTRONA

20. IMUNOELEKTRONSKA MIKROSKOPIJA • UZORAK SE PRETHODNO MEŠA SA POZNATIM ANTIVIRUSNIM ANTITELIMA (OBIČNO MONOKLONSKIM) • ZATIM SE ELEKTRONSKIM MIKROSKOPOM TRAŽI IMUNOLOŠKA REAKCIJA IZMEĐU DODATIH ANTITELA I VIRUSA • NA OVAJ NAČIN SE POSTIŽE DOKAZIVANJE VIRUSA I NJEGOVA IDENTIFIKACIJA što se ne postiže elektronskim mikroskopom

21. DOKAZIVANJE VIRUSNIH ANTIGENA • DIREKTNA , INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA i ANTIKOMPLEMENTARNA TEHNIKA kvalitetan uzorak, poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena fluorofromom i fluorescentni mikroskop • ENZIMSKI IMUNOESEJ ELISA poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena enzimom i ELISA procesor • RADIOIMUNOESEJ poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena radioizotopom

22. DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMA • HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI • PRINCIP HIBRIDIZACIJE • VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOM

23. DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMA • HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI • PRINCIP HIBRIDIZACIJE • VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOM

24. BLOT HIBRIDIZACIJA • Za dokazivanje virusne DNK koristi se blot hibridizacija • Nakon EKSTRAKCIJE DNK iz uzorka vrši se DENATURACIJA kuvanjem čime se dobijaju fragmenti jednostruke nukleinske kiseline dugi nekoliko stotina nukleotida koji se vezuju za čvrstu podlogu - nitroceloloznu ili najlonsku membranu U fazi HLAĐENJA vrši se ANELACIJA vezivanje jednolančanih nukl. kiselina za oboležene probe čime se formiraju hibridi

25. hibridizacija in situ ZA IN SITU HIBRIDIZACIJU intracelularna DNK se fiksira za predmetno staklo u tankim histopatološkim rezovima tkiva Pozitivan rezultat se očitava u vidu tačke, kruga ili dugmeta

26. POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR • PREDNOSTI • OSETLJIVOST (virus se otkriva u koncentraciji 10 čestica po 1ml) • SPECIFIČNOST • BRZINA • NEDOSTACI visoka cena i mogućnost kontaminacije KARY Mullis, 1984/85

27. POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR 1.DENATURACIJA na temperaturi 94 stepeni C razdvajanje lanaca DNKI dobijanje dva jednostruka lanca 2.ANELACIJA SPARIVANJE specifične genetske probe (sintetski dobijeni jednostruki lanci DNK od 20-30 nukleotida) vezuju se za sebi komplementaran deo originalnog lanca DNK na 40-60

28. POLIMERIZACIJA NUKLEINSKIH KISELINA PCR 3.EKSTENZIJA PRODUŽAVANJE LANACA DNK dva kratka dvostruka lanca DNK služe kao inicijalna mesta za dejstvo enzima Taq polimeraze uz čiju pomoć se od 3* kraja probe komplementarno vezuju nukleotidi Ova faza se odigrava na 72 stepena C TRI FAZE U CIKLUSU NAIZMENIČNO SE PONAVLJAJU I BROJ DVOSTRUKIH LANACA SE UDVOSTRUČAVA

29. SAVREMENI SEROLOŠKI TESTOVI • 1.IMUNOTESTENZIMSKI TEST ELISA • 2.IMUNOFLUORESCENTNI TEST • 3.RADIOIMUNOESEJ • KARAKTERISTIKE • VISOKA OSETLJIVOST I SPECIFIČNOST • DOKAZIVANJE KLASA IMUNOGLOBULINA • ZA DIJAGNOZU JE ČESTO DOVOLJAN JEDAN UZORAK SERUMA TE TESTOVI ZA IgM SPADAJU U TESTOVE ZA BRZU I RANU DIJAGNOSTIKU

30. INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATA

31. Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova ZA DOKAZIVANJE AKUTNE VIRUSEINFEKCIJE POTREBNA SU DVA UZORKA SERUMA PRVI UZORAK NA POČETKU BOLESTI DRUGI UZORAK POSLE DVE NEDELJE OD PRVOG UZORKA

32. Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova INFEKCIJA JE AKUTNA AKO SE DOKAŽE ČETVOROSTRUKI ILI VEĆI PORAST ILI PAD TITRA U DRUGOM UZORKU ILI SEROKONVERZIJA: PRVI UZORAK JE NEGATIVAN A DRUGI POZITIVAN