Auto protilátky v diagnostice autoimunitních onemocnění

1. Autoprotilátky v diagnostice autoimunitních onemocnění Praktikum Modul II A Lenka Rossmeislová

2. Autoimunitní onemocnění • jsou důsledkem komplexních patologických pochodů, charakterizovaných abnormální reakcí na vnitřní antigeny (autoantigeny) kombinované s působením vnějších činitelů • o autoimunitních imunopatologických reakcích hovoříme tehdy, když v jejich průběhu dochází k poškození tkání • podmínkou vzniku autoimunitních onemocnění je prolomení autolerance, tedy mechanismů, udržujících imunitní reakci vůči vlastním tkáním ve fyziologických mezích

3. Autoimunitní onemocnění • postihuje asi 5 – 7 % populace Teoretickým kritériem autoimunitního onemocnění je • charakterizace autoantigenů • průkaz existence autoprotilátky, • průkaz autoreaktivních lymfocytů T, které reagují s autoantigenem Základní rozdělení • orgánově specifická • systémová (poškození zprostředkované imunokomplexy)

4. Autoimunitní onemocnění • projev- zánět s dominující poškozující složkou • multifaktoriální, vícestupňové, dlouhodobé • u žádného z onemocnění dosud nebyly přesně a jednoznačně specifikovány příčiny

5. Autoimun. onemocnění-vnitřní faktory • asociace s MHC (HLA) (nejznámější je asociace HLA B27 s Bechtěrevovouchorobou) • polymorfismy genů kódujících cytokiny(deficit nebo nadbytek určitého cytokinu) • polymorfismy genů řídících apoptózu(při poruše apoptózy aktivovaných lymfocytů nedochází k adekvátní regulaci a ukončení imunitní reakce) • asociace s imunodeficity • polymorfismy genů kódujících TcR a H řetězce imunoglobulinů, TAP aj. • faktory hormonální (většina autoimunitních chorob je častější u žen, incidence se často zvyšuje v dospívání a po porodu).

6. Autoimun.onemocnění-vnější příčiny • nejvíce se uplatňuje infekce, stres, léky, chemikálie a UV záření • infekce odkryje dosud nedostupný antigen, místní zánět pak napomáhá odkrytí dalších autoantigenů - „epitop spreading“, pod vlivem zánětlivých cytokinů může dojít k expresi kostimulačních molekul a k následné stimulaci anergických autoreaktivních klonů. • některé mikrobiální superantigeny mohou vyvolat polyklonální aktivaci B lymfocytů (superantigeny jsou definovány jako antigeny, které nevyžadují pro svou interakci s imunitním systémem zpracování antigen prezentujícími buňkami). • Léky a UV záření se zřejmě mohou podílet na modifikaci autoantigenů, stresové faktory se uplatňují zejména prostřednictvím neuroendokrinní osy.

7. Autoprotilátky • přítomnost autoprotilátek je obvykle asociována s imunopatologickým procesem • intenzita poškozujícího zánětu obvykle koreluje s množstvím autoprotilátek • častým cílem jsou multimolekulové komplexy přítomné v buňce (ATPáza, cytochromy aj.) • v nízkých koncentracích se vyskytují fyziologicky • jejich výskyt stoupá s věkem

8. Imunofluorescenční průkaz protilátek • Užívá se k detekci autoprotilátek reagujících s antigeny přítomnými v tkáních nebo lokalizovaných nitrobuněčně • Hladina protilátek se mění v závislosti na aktivitě choroby. Jako substrát slouží: • zvířecí orgánové řezy (orgánově-specifické protilátky, AMA) • buněčné suspenze: Hep-G2 buněčná linie (ANA) lidské granulocyty (ANCA)

9. Nepřímá imunofluorescence-princip

10. Nepřímá imunofluorescence Výhody Nevýhody • Umožňuje otestovat protilátky bez přesné znalosti antigenu • Zjištěný pattern usnadňuje diagnózu • Zjištění titru protilátky (semikvantitativní metoda) • Není high-throughput • Vyhodnocení závislé na zkušenosti technika

11. Typy autoprotilátek-přehled • ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÉ (proti mitochondriím, buněčným jádrům) • ANA-antinuclearantigens • ANCA-antineutrophil cytoplasma antigens • AMA-antimitochondrialantigens • ORGÁNOVĚ SPECIFICKÉ • EMA – endomysium antigen • APCA –antiparietal cell antigen

12. ANA-antinuclear antigens • skupinaprotilátekprotikomponentámbuněčnéhojádra, protilátkyprotiss- a ds-DNA, histonům a extrahovatenýmjadernýmantigenům (anti-ENA) • jadernéantigenyjsouantigenykryptickýmitzn. zanormálníchpodmínek pro imunitnísystémnedostupné • různétypy fluorescence: homogenní, zrnitá, nukleolární,… • Pozitivita ANA se vyskytuje u: REVMATOIDNÍ ARTRITIDA SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTEMATODES SKLERODERMIE POLYMYOZITIDA SJOGRENŮV SYNDROM • PozitivitaANA se u 10% zdravé populace vyskytujevevyššímvěku (nad 60 let)

13. ANA-homogenní jaderná plasma • difúzní fluorescence zahrnující celou jadernou plazmu • antigen: DNA, histony • klinická asociace: systémový lupus erythematodes lékový lupus revmatoidní artritida systémová skleróza A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

14. ANA-zrnitá fluorescence • skvrnité barvení jádra, stejnoměrně distribuované, někdy velmi husté • antigen: řada nukleárních proteinů (SS-A/Ro, SS-B/La, RNA polymerázy II a III) • klinická asociace: systémový lupus Sjőgrenův syndrom sklerodermie A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

15. ANA-dsDNA • Jako substrát je využíván prvok Crithidialuciliae, který obsahuje kinetoplast (mitochondrie) obsahující dsDNA. Kinetoplast neobsahuje ssDNA ani histony a další antigeny. • antigen: dsDNA • klinická asociace: významný autoantigen u systémového lupusu, se specifitou okolo 95%. pozitivní negativní A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

16. ANA-jadérková fluorescence • fluorescence celého jadérka • antigen: PM-Scl nebo nukleolinový komplex deseti polypeptidů Ku antigen (66 a 68 kDa) • klinická asociace: překryvný syndrom (50%) plicní hypertenze se sklerodermií A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

17. ANA-centromerová fluorescence • Stejnoměrně oddělená zrna rozprostřená v jádře (40-60 zrn). Buňky v telofázi a metafázi mají zrna umístěná v oblasti „rovníku.“ • antigen: kinetochory chromozómů, které mohou být namířeny proti několika centromérovým antigenům (CENP-A,B,C,D,E) • klinická asociace: CREST syndrom progresivní systémová skleróza sklerodermie A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

18. Přesné určení antigenu ANA • je možné v případědostupnostimolekulovědefinovanýchantigenů • molekulovéterče pro antinukleárnífaktoryjsouprodukoványbiotechnologicky • k průkazuslouží: testy ELISA imunoblotovétechniky

19. ANCA-antineutrophil cytoplasma antigens • substrátemjsouetanolemneboformalínemfixovanélidskégranulocyty • přítomny u nemocných s některýmitypyvaskulitid • typy • p-ANCA (fluorescence perinukleární) • c-ANCA (fluorescence cytoplazmatická) • a-ANCA atypická

20. c-ANCA • Fluoreskuje celá cytoplazma, mnohdy jsou dobře rozlišitelná jednotlivá granula v podobě zrnité fluorescence. Jádro nesvítí. • antigen: proteináza 3 přítomná v primárních granulích • klinická asociace: protilátky jsou hlavním laboratorním markerem pro Wegenerovu granulomatózu primární vasculitidy nekrotizující glomerulonefritida Churg-Straussová syndrom

21. p-ANCA • Při fixaci etanolem se některé cytoplazmatické antigeny shlukují okolo jádra. Navenek se tento stav jeví jako fluorescence jádra s prosvětleným středem či jako prstenec okolo jádra. • antigen: enzym myeloperoxidáza (MPO) kathepsin, elastáza, laktoferin, lysozym, BPI • klinická asociace: Cystická fibróza (90%) chronická hepatitida (80%) mikroskopická polyangiitida primární vasculitida primární sklerotizující cholangoitida systémový lupus revmatoidní artritida

22. SLE– systémový lupus erythematodes • systémové autoimunitní onemocnění • autoprotilátky proti jaderným antigenů (specifické pro SLE jsou především antids-DNA a antiSm) a krevním elementům • poškození způsobené tvorbou imunokomplexů Ab-Ag vyvolávajících zánět • 90 % pacientů jsou ženy

23. AMA-antimitochondrial antigens • Substrátem pro detekci je řez z krysích, opičích ledvin i Hep-2 buňky. • antigen: pyruvát dehydrogenáza (M2 antigen) • klinická asociace: primární biliární cirhóza PBC (95%) A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

24. Autoprotilátky proti cytoskeletu • Fluorescence cytoskeletu • antigen: cytokeratin, tropomyosin, vimentin, vinculin, desmin • klinická asociace: chronická onemocnění pojiva, CAH, Crohnova choroba A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

25. Orgánově specifické autoprotilátky-proti parietálním buňkám žaludku (APCA) • Fluorescence mitochondrií • antigen: H+/K+/ATP-áza • klinická asociace: perniciózní anémie (80-90%), vyšší incidence u žen, autoimunitní endokrinní choroby, souvislost s věkem, u osob nad 60 let až 15% pozitivních nálezů A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

26. Orgánově specifické autoprotilátky-EMA (endomysium) • Substrátem je opičí oesophagus, event. lidský pupečník Cílovým místem pro pozorování je muscularismucosa. V případě pozitivity fluoreskují vlákna (obal) buňky hladkého svalu • antigen: tkáňová transglutamináza • klinická asociace: celiakie A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

27. Shrnutí-autoprotilátky • Vznikají na základě kombinace vnějších a vnitřních faktorů, které napomáhají prolomení autotolerance • Typy autoprotilátek-orgánově nespecifické (proti základním buněčným strukturám) a specifické (proti proteinům typickým pro danou tkáň) • Detekce-imunofluorescence, ELISA, WB