Serologické metody v diagnostice nejen rostlinných patogenů

1. Serologické metody v diagnostice nejen rostlinných patogenů Metody využívající kompatibilní reakce antigenu a protilátky Některé texty a obrázky jsou použity z veřejně dostupných webových zdrojů.

2. Vymezení základních pojmů a vztahů Protilátka Antigen Anti = proti (řecky) gen = od gegnomai tvořit Antigeny jsou částice, které mohou stimulovat tvorbu protilátek. Mohou být buď přirozené nebo chemicky syntetizované, mohou být buď větší (bakterie, proteiny, sacharidy) nebo malé molekuly, někdy se stávají antigeny i buňky vlastního organismu. V mikrobiologii se využívají jako antigeny celé mikroorganismy nebo jejich části - těla, bičíky, různé extrakty.

3. Makroorganismus rozpoznává povrchový znak, který označujeme jako antigenní determinantu = epitop.Epitop je právě imunologická část, kterou protilátka rozpozná a je schopna se na ni navázat. Antigeny mají většinou více epitopů, které prokazujeme specifickými metodami. Struktura epitopů podle původu a typu antigenu proteinové: determinanty tvoří zpravidla aminokyselinové zbytky na konci peptidových řetězců

4. polysacharidové:determinanty tvoří jednotky monosacharidů nukleové kyseliny: determinanty tvoří několik nukleotidů nebo případně purinových pyrimidinových bází

5. Rozdělení Epitopů Sekvenční determinanty určuje posloupnost (sekvence) základních subjednotek biopolyméru (aminokyselin, monosacharidů, nukleodidů). Přitom subjednotky mohou být v různé náhodné konformaci. Konformační determinanty tvoří jen jedna možná konformace určité části molekuly antigenu (polypeptidového nebo polysacharidového řetězce). Jsou typické pro nativní antigeny. Denaturací proteinových antigenů se mění prostorová struktura a tím i specifičnost konformačních antigenů. Specifičnost sekvenčních antigenů se denaturací nemění.

6. Protilátky.Za tvorbu protilátek jsou zodpovědné B lymfocyty z kostní dřeně. Protilátky jsou imunoglobuliny. Molekuly imunoglobulinů jsou složeny ze dvou lehkých a dvou těžkých polypeptidových řetězců uspořádaných do písmeneY.

7. Na molekule imunoglobulinu dále rozeznáváme část konstantní a část variabilní. Právě na variabilní části řetězce nacházíme aktivní neboli vazebné místo, které se specificky váže s antigenní determinantou (=epitopem). Imunoglobuliny můžeme rozdělit podle kvality těžkých řetězců do pěti skupin: IgG, IgA, IgM, IgE a IgD.Základní funkcí protilátek je jejich vazba na specifický antigen, jeho neutralizace, opsonizace nebo aktivace komplementu.

8. REAKCE ANTIGEN PROTILÁTKA Základem reakcí je vznik biospecifické vazby mezi vazebnými místy protilátky a determinantními skupinami antigenu za vzniku protilátkově-antigenních komplexů (imunokomplexů). Při interakcích antigenu a protilátky se uplatňují stejné nekovalentní interakce jako např. enzym-substrát. Síly podílející se na vazbě antigen protilátka VODÍKOVÉ VAZBY NEPOLÁRNÍ HYDROBÓBNÍ INTERAKCE COULOMBOVY SÍLY VAN DER WAASOVY SÍLY LONDONOVY DISPERZNÍ PŘITAŽLIVÉ SÍLY STÉRICKÉ ODPUDIVÉ SÍLY

9. VODÍKOVÉ VAZBY interakce elektronově deficitního protonu se dvěma atomy s velkou elektronovou hustotou (elektronegativní atomy). Proton vytváří můstek mezi atomy V případě proteinů se vodíkové můstky tvoří mezi hydrofilními skupinami (-OH, -NH2, -COOH) -O…H…O- -O…H…N- -N…H…N- HYDROFÓBNÍ INTERAKCE vznikají při dostatečném přiblížení dvou hydrofóbních povrchů. Zúčastňují se jich aminokyseliny leucin, izoleucin, valin a fenylalanin. Nevytvářejí s molekulami vody vodíkové můstky, a proto ve vodných roztocích dávají přednost vzájemným interakcím, při kterých se odstraní molekuly vody, které hydrofóbní skupiny obklopovaly. Molekuly proteinů ve vodném prostředí se snaží zaujmout takovou polohu, aby jejich hydrofóbní skupiny byly co nejblíže sobě, čímž se vyloučí nebo omezí kontakt s molekulami vody. Takto uspořádané molekulyse tím dostávají do energeticky výhodnějšího stavu, protože získávají entropii. Hydrofóbní interakce patří v reakcích antigenů a protilátek k nejvýznamnějším. COULOMBOVY SÍLY vznikají na základě vzájemného přitahování opačně elektricky nabitých funkčních skupin nebo molekul. V molekulách proteinů jsou to obyčejně koncové aminokyselinové jednotky jako je lysin, arginin, histidin, kyselina asparágová a glutámová. Při interakci antigen-protilátka se s nimi často setkáváme, ale nemají tak rozhodující vliv jako hydrofóbní interakce.Např. proti kladně nabitým hapténům vzniknou záporně nabité protilátky. VAN DER WAALSOVYSÍLYNáboj na jedné molekule nebo atomové skupině může indukovat vznik dipólu na druhé molekule. Základem je vzájemné ovlivňování elektronových oblaků dvou polárních skupin atomů.Výsledkem působení jednoho elektronového oblaku na druhý je vznik oscilujících dipólů na obou skupinách.Takto vzniklé dipóly se vzájemně přitahují na místech, kde mají opačně nabité náboje.VAN DER WAALSOVY SÍLY se uplatňují hlavně při stabilizaci imunokomplexů. LONDONOVY DISPERZNÍ SÍLY Při interakci elektronových oblaků dvou nepolárních skupin atomů vznikají podobné přitažlivé síly.Disperzní síly jsou podmíněné fluktuacemi elektronů,a proto se uplatňují bez vzniku permanetních dipólů Síla vazby se výrazně zvyšuje se zmenšováním vzdálenosti mezi reagujícími skupinami. Pro všechny síly uplatňující se při interakci antigen-protilátka platí základní požadavek, co nejtěsnějšího přiblížení obou reagujících skupin, pak se mohou přitažlivé síly uplatnit. Aby se mohly uplatnit, musí překonat sterické odpudivé síly STERICKÉ (PROSTOROVÉ) ODPUDIVÉ SÍLY vznikají mezi dvěma atomy, které nejsou spojené chemickou vazbou, a to na základě vzájemného prolínání jejich elektronových oblaků. Čím větší komplementárnost mají oba typy oblaků, tím menší odpudivé síly jsou mezi nimi. Tyto síly jsou základním faktorem, podle kterého se protilátka vybírá vhodný antigen pro interakci.Nespecifické antigenové determinanty nemají vazebná místa na molekule protilátky, proto jsou mezi nimi velké odpudivé síly, které brání mezi omezují tvorbu vazby na minimum (křížové reakce).Když jsou elektronové obaly determinantu vazebného místa komplementární, odpudivé síly jsou malé a mohou převládnout přitažlivé síly, které pak realizují imunospecifickou vazbu. V tomto případě má protilátka pro antigen vysokou afinitu

10. Sérologické reakce reakce hodnotíme kvalitativně a kvantitativně. Sledujeme dynamiku protilátek, tj. jejich zvýšení nebo snížení v závislosti na čase. Při stanovení kvantity sérum nebo jinou tělní tekutinu, ve které chceme protilátky prokázat, ředíme fyziologickým roztokem geometrickou řadou. Reciproká hodnota nejvyššího ředění, ve kterém ještě došlo k pozitivní reakci, se označuje jako titr. Cílem kvantitativní sérologické reakce je tedy zjištění titru. Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky váží se na více antigenních determinant antigenu váží se na jedinou determinantu Přípravě obou typů protilátek předchází výběr a příprava antigenu

11. Metody přípravy antigenu Záskání antigenu přirozenou cestou z patogena Pro získání antigenu touto cestou je nejprve nutné zvýšit koncentraci patogena na úroveň využitelnou pro imunizaci. K tomuto účelu lze zvolit různé strategie pro různé patogeny. Izolace antigenu je pak závislá na ceé řadě faktorů, které mají vliv na kvalitu, kvantitu a v neposlední řadě i cílenost žádaného antigenu. Zejména při strategii in vivo izolujeme zpravidla směs případných antigenů, které je nutné později separovat. Jako separační metody jsou využívány metody centrifugační resp. ultracentrifugační v gradientu obv. sacharozy. Pro purifikaci kapsidového proteinu virů lze rovněž s úspěchem použít chromatografickék metody, precipitační metody různými solemi nebo PEG. Nelze opominout ani metody elektroforetické SDS PAGE v tomto případě není ani nutné oddělené partikule izolovat z gelu a po homogenizaci lze okamžitě použít pro imunizaci. In vitro (BCT) In vivo (viry)

12. Rekombinantní antigen Při znalosti genomu patogena lze využít pro přípravu antigenu a strategii rekombinantních molekul. V takových případech použijeme známou sekvenci pro přímou syntézu žádaného polypetidu službou. V některých případech lze daný úsek vložit do vhodného plasmidu a tento transformovat do vhodného klonu bakterie, nejčastěji pak E.coli, a ta exprimuje žádaný protein. Ze směsi je pak možné jej rychle purifikovat SDS PAGE a použít pro imunizaci. cDNAcloning exprese Transformace selekce

13. In silico syntetický antigen protein cDNA Syntéza Konjugace s nosičem

14. Příprava polyklonálních protilátek Výběr zvířete

15. Imunizace -postup vytváření imunity v organizmu, tedy tvorba protilátek. Pro vnesení antigenu do těla zvířete lze použít několik strategií mezi základní patří injekční a operativní. pankreas operativní Intramuskulární Injekční slezina Dutina břišní Intravenozní Intrapeitoneální

16. Časový rozvrh pro imunizaci Pro úspěšnou imunizaci je nutné dávky antigenu opakovat a to v týdenních intervalech. Za 6-7 týdnů je zpravidla titr protilátek dostatečně vysoký a je tedy možné přistoupit k purifikaci protilátek. Po celo dobu imunizace je nutné sledovat nárůst titru protilátek v séru. Na závěr je tedy vhodné aplikovat větší dávku antigenu (booster) pro získání nejvyššího titru. Příprava IgG Získání krve Separace séra Krev v laboratorní teplotě se přirozeným způsobem sráží, tekutá část je sérum, které lze po filtraci dlouhodobě skladovat lyofilizované nebo rozpuštěné v glycerolu v -30 C°. IgG lze purifikovat precipitací, chromatograficky, nebo pomocí afinitní chromatografie. Možná je i ultracentrifugace v gradientu. Jako poslední krok při přípravě polyklonálních protilátek je pochopitelně jejich testování specifity. Testování specifity

17. Příprava monoklonálních protilátek Jelikož jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek. Zatímco mateřský normální B lymfocyt (od imunizovaného dárce) je nositelem specifity produkované protilátky, myelomová buňka je nositelem vysokého až neomezeného proliferačního potenciálu, nesmrtelnosti. Hybridom tedy zdědí po myelomové buňce možnost nepřetržitého růstu a po aktivovaném B lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonální protilátku namířenou proti jedné antigenní determinantě.

18. Jako zdroj aktivovaných B lymfocytů se používají slezinné buňky myší, které byly imunizovány. Je ovšem nutné použít myelomové buňky s nějakou vlastností, která umožní selekci pozitivně fusovaných buněk. Jaké myelomové buňky zvolit? -Postrádajíschopnostsyntézy hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase (HGPRT). Tento enzym umožňuje bunkám syntézu purinů pomocí extracelulárního zdroje hypoxantinu jako prekurzoru. Obyčejně není absence HGPRT problém, protože buňky mají alternativní způsob syntézy purinů. Pokud jsou buňky vystaveny působení aminopterinu(analog folic acid) , jsou neschopné využít jiné zdroje pro syntézu purinů a jejich přežití je striktně vázáno na HGPRT. -Ztracená schopnost tvorby jakékoli protilátky

19. 1.Jakoprvníkrok je nutnépřesunoutfuzovanébuňky do kultivačního media, kterému se říkáHATmédiumprotožeobsahuje: hypoxanthine aminopterin the pyrimidinethymidine Logické závěry: -nespojenémyelomovébuňkynemohourůst, neboťpostrádají HGPRT. -normálnslezinnénefůzovanébuňkynerostouprotožepřekročilydobusvojíživotnosti -hybridomovébuňkyvyprodukovanéúspěšnoufúzíjsouschopnyrůst, neboťslezinnébuňkydodávají HGPRT myelomovýmbuňkám. 2.Supernatant v každé buněčné kultuře pak obsahuje žádané protilátky 3. Vzhledem k tomu že původní buněčná kultura nemusí pocházet pouze z jedné hybridomové buňky, je tedy nutné izolovat jednu buňku a podrobit nové kultury screeningu. 4. Opětovně otestovat supernatant na přítomnost hledané protilátky. Každá pozitivní kolonie reprezentuje klon a tudíž protilátky, které produkuje jsou monoklonální. To znamená, že kolonie produkuje jeden druh protilátek specifických pouze k jedné determinantě použitého antigenu.

20. Produkce McAb In vitro In vivo

21. Jednoduchá Difuse v agaru Princip: antigen v tekuté fázi difunduje do agaru, ve kterém je obsažena protilátka. Při pozitivní reakci vzniká precipitační linie. Precipitát je výsledkem tvorby trojrozměrné mřížkové struktury po interakci: polyvalentního antigenu s polyvalentní protilátkou. Antigen v tekuté fázi Agar s protilátkou Precipitační linie

22. Jednoduchá horizontální difuse Otvor s antigenem Precipitační linie Agarozová plotna s protilátkou

23. Dvojitá difuse ve zkumavce Tekutá fáze antigen Precipitační linie agar Protilátka v agaru

24. Dvojitá difuse horizontální Rozmístění jamek pro aplikaci antigenu a protilátky může být odlišné pro různé viry či aplikace. Uspořádání jamek hraje důležitou roli při studiu vztahů mezi antigenem a protilátkou.

25. Tvar precipitační linie může napovědět v jakém jsou k sobě antigeny vztahu, zkráceně tedy můžeme dospět k těmto závěrům. B A A A AB A Ax C A AB AAx ABC Identický antigen Rozdílný antigen Některé determinanty jsou rozdílné Jeden antigen inhibuje druhý

26. mikroaglutinace a mikroprecipitace Princip: Tato metoda není náročná na množství antigenu a protilátky, a je citlivější než testy difusní. Pro vyhodnocení je nutné použít mikroskop. Za využití malého množství regencií je možné dosáhnout reprezentativního výsledku. Neprecipitující protilátky:- monovalentní nebo univalentní - konvenční protilátky (mají jen jedno vazebné místo) Příčina neprecipitace: nízká afinita protilátek musí se přidat velký nadbytek antigenu, aby mohl reagovat aspoň s některými vazebnými místy, nadbytek brání, aby proběhla druhá fáze precipitace: agregace malých komplexů

27. Imunoelektroforéza Tato metoda je kombinací mezi rozlišením agarozové elektroforézy a specifitou a citlivostí imunoenzymatické difuse v agaru. Je tedy možné rozlišit např. viry, které jsou si velmi blízké a rovněž pak aplikovaat několik různých IgG v jedné reakci.

28. Pevný nosič ELISA-Enzyme linked immunosorbent assay Metoda má řadu variant; všechny jsou založeny na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidasa nebo alkalická fosfatasa). Tento enzym katalysuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný (stanovuje se spektrofotometricky, viz chromogenní substrát) nebo fluoreskující (fluorimetrické stanovení); koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul.

29. Nepřímá kompetitivní ELISA Princip této metody je založen na tom, že antigen zakotvený na pevný nosič soutěží se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekukách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a následně se přidá enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Konečná detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt. Intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky. Výhodou tohoto stanovení je možnost použití komerčně připravených značených protilátek (např. prasečí IgG proti králičím IgG).

30. Přímá nekompetitivní ELISA - "sandwich DAS Nejčastěji využívané uspořádání enzymové imunoanalýzy na pevné fázi (ELISA) pro stanovení patogenů je přímý nekompetitivní (tzv. „sendvičový“) formát. V prvním kroku jsou na pevnou fázi imobilizovány protilátky. Poté je přidán antigen, který interaguje s navázanými protilátkami. Po odstranění nenavázaných složek následuje aplikace protilátky značené enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, b-galaktosidasa a glukosa oxidasa). K detekci je využita enzymová reakce, kdy je bezbarvý substrát přeměněn na barevný.

31. DIBA dot immunobinding assay Membrány jsou vhodným terčem pro aplikaci různých imunoenzymatických metod. V závislosti na aplikaci lze vybrat mezi nylonovými a nitrocelulozovými membránami. Preferovány jsou zejména nylonové membrány. Co se týče antigenu, vhodná je pochopitelně aplikace nativního. Při aplikaci protilátek lze rovněž volit mezi monoklonální či polyklonální variantou. V neposlední řadě je nutné zvolit detekční systém. Může se jednat o enzymatický, fluorescentní či radioaktivní systém. Lze aplikovat jak přímé tak nepřímé či sendvičové uspořádání protilátek, tak jak daná metoda vyžaduje. Aplikace BR vyvázání Nespecifických derterminant Nanesení antigenu Aplikace McAb Aplikace conjugátu vizualizace

32. Po rozdělení proteinů na SDS PAGE přichází jejich přenos na membránu pomocí elektroblotingu. Po přenosu je nutné proteiny zafixovat a dále pak s použitím specifických protilátek identifikovat hledaný protein (virus atp.) Western Bloting

33. Imunofluorescence Tato metoda byla vyvinuta k detekci antigenu přímo ve tkáních či organelách, je možné použít buď přímé či nepřímé značení v závislosti na druhu a povaze antigenu.

34. Aglutinační metody (LA-latex agglutination) Uniformní latexové částice jsou pokryty protilátkami, v případě použití takto připravených protilátek a kompatibilního antigenu lze dosáhnout během několika minut tvorby sraženiny, kterou lze snadno sledovat.

35. SSEM serologicallyspecificelectronmicroscopy Potažení sítěk protilátkou Aplikace suspenze s viry Barvení virů Uranyl acetátem

36. IEM immunoelectron microscopy Aplikace druhé protilátky konjugované s koloidním zlatem Řez pletiva připraven na síťce Aplikace první protilátky