2. Estructura y Propiedades de Proteínas

1. 2. Estructura y Propiedades de Proteínas Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus

2. Ciclo de Cori ↑Demanda de ATP ↓O2 Sangre Hígado Músculo Glucosa Glucosa Glucógeno ADP + GDP + Pi ADP + Pi Gluconeogénesis Glucogenolisis y Glucólisis ATP + GTP ATP Piruvato NADH L-Lactato L-Lactato Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Lactato NAD+

3. 2. Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

4. ¿Para qué purificar una proteína? • Lipasa • Hexosa oxidasa • Vacuna Hepatitis B • Insulina • Gelatina • Proteínas recombinantes varias • Pectinoesterasas • Suero fetal bovino • Colorante de carne • Proteína liofilizada

5. ¿Por qué Queremos Purificar una Proteína? • Precisar secuencias de aminoácidos. • Establecer relaciones evolutivas. • Investigar la función bioquímica. • Establecer relaciones estructura-función. • Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas

6. GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

7. GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

8. GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA

9. Fases de la Purificación • Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína. • Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus. • Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible.

10. Definir las Propiedades de la Proteína de Interés

11. Seleccionar la Fuente de Proteína • La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como: • la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína, • la cantidad de la proteína de interés en el tejido y • cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento.

12. Ruptura de la Célula¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD • Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas. MÉTODOS • Suaves: • Lisis celular (choque osmótico) • Digestión enzimática (lisozima) • Lisis química (detergentes) • Homogenización manual • Molienda • Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.

13. Ruptura de la Célula¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante? ESTABILIDAD MÉTODOS • Moderados: • Homogenización con cuchillas • Molienda abrasiva • Congelamiento • Vigorosos: • Ultrasonicación • HomogenizadorManton-Gaulin • Prensa francesa • Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.

14. Seleccionar la Fuente de Proteína

15. Seleccionar la Fuente de Proteína Aditivos

16. Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial • Eliminar contaminantes o clarificar la muestra • Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. • Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.

17. Homogenización del tejido Diagrama para la obtención de diferentes fracciones celulares Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’) Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación media (20 000 g, 20’) Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación alta (80 000 g, 1 h) Tejido homogenado Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación muy alta (150 000 g, 3 h) Fraccionamiento Celular: Centrifugación Diferencial Pellet, contiene células completas, núcleos, membranas plasmáticas Pellet, contiene mitocondrias, lisosomas, peroxisomas Sobrenadante contiene proteínas solubles Pellet, contiene microsomas (fragmentos de RE), vesículas pequeñas Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas grandes

18. Otros compuestos utilizados para formar el gradiente: detergentes no iónicos, Ficoll, Percoll, Nycodenz y Optiprep. Centrifugación Fraccionamiento Celular: Gradiente de Densidad Muestra Gradiente de Sacarosa Componentes menos densos Fraccionamiento Componentes más densos

19. Remover contaminantes y/o Concentrar la Muestra • Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos: Ultrafiltración Liofilización Precipitación

20. Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD • La solubilidad de una proteína es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica. • Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína. • El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. ¡Y es el que vamos a hacer en la práctica! Sin embargo, también hay otros métodos… Pp con solventes orgánicos. Pp isoeléctrica. Pp térmica.

21. Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Log (S/S’) Fuerza Iónica

22. Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD Solubilidad Capa de Hidratación Salting in Salting out Concentración de sal

23. Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD

24. Existen tablas que nos indican cuanto añadir de sulfato de amonio

25. Y también en internet http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl • Conocer: • Sulfato de amonio sólido • Conocer el volumen de la solución • Y la concentración final de la sal

26. ¿Cómo vamos a purificar a la LDH de Gallusgallus?

27. Propiedades de LDH de Gallusgallus