Genová terapie a jiné terapeutické molekulárně genetické přístupy

1. Genová terapie a jiné terapeutické molekulárně genetické přístupy • Rekombinantní proteiny a „genetically engineered“ vakcíny • Expresním klonováním produktů normálního genu (klonované geny jsou exprimovány v mikroorganismech nebo transgenních livestock), které slouží k tvorbě velkých množství medicínsky cenných produktů • Produkcí geneticky „engineering“ protilátek (geny pro protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické použití • Produkcí „genetically engineered“ vakcín-především proti tumorům a infekčním agens.

2. Genová terapie: typy nemocí • Infekční nemoci • Rakoviny • Vrozené nemoci • Nemoci imunitního systému

3. Genová terapie • Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta. • Do buněk se transferují: geny nebo jejich části nebo oligonukleotidy. • Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk pacienta • Genová terapie in vitro: genové modifikace probíhají mimo organismus • Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se vracejí do organismu

4. Genová terapie • Klasická genetická terapie (dopravit geny do vhodných cílových buněk, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů) s cílem: • 1. zajistit produkci látky, která chybí • 2. aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky

5. Neklasická genová terapie • Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou • Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese • Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací. Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací.

6. Rekombinantní léky je možno produkovat expresním klonováním v mikroorganismech nebo v transgenních zvířatech • V mikroorganismech: • Výhody: dostatečná množství produkovaných látek • Nevýhoda: Pozměněné produkty v důsledku odlišných posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární strukturou (glykosylace) problémy s purifikací • V transgenních zvířatech: možnost navodit podobné posttranslační systémy jako u člověka

7. „Genetically engineered“ protilátky a vakcíny • Uměle produkované terapeutické protilátky jsou navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ antigenního místa) a poznají specifické antigeny asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných buněk • Typy nemocí: • Lymfomy, leukemie, infekční nemoci, autoimunitní nemoci. • Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk (vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit (nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor).

8. Chimerické a humanizované protilátky • Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí • Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat velké množství protilátek a zároveň zabránit imunitní odpovědi lidského příjemce: • chimerické V/C protilátky) • CDR (complementarity determining regions) graft protilátky • Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk

10. Plně lidské protilátky • Technologie fágového displaye: protilátky jsou tvořeny in vitro napodobováním selekční strategie imunitního systému • Transgenní myši: Transfer kvysinkových umělých chromozomů s velkými segmenty lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších embryonálních buněk. Narozené myši obsahují velmi pozoruhodnou porci lidských V genetických segmentů a jsou schopny tvořit lidské protilátky

12. „Geneticky enginnered“ vakcíny • Pomocí rekombinantní technologie: • Vakcíny nukleových kyselin: • bakteriální plasmidy s geny pro patogeny nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v solném roztoku. Obsahují silný virový promotor. • „gene gun“ - zlaté perly, do nichž byla precipitována DNA

13. „Geneticky enginnered“ vakcíny • Genetická modifikace antigenu – např. fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení antigenicity • Genetická modifikace virů- virové vektory • Genetické modifikace mikroorganismů, které způsobí: • odstranění genů nutných pro patogenezu • expresi exogenního genu v bakteriích nebo parazitech po jeho inzerci do těchto organismů

14. Technologie klasické genetické terapie • Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně • Geny mohou inzertovány do buněk pacienta přímo a nepřímo • Inzertované geny se mohou • Integrovat do chromozomů • Zůstat extrachromozomálně (epizomy)

15. Technologie klasické genetické terapie • Metody k zacílení nepostižených buněk: • Buněčné zabíjení, způsobené imunitním systémem- jde o podporu imunitní odpovědi namířené proti nádorovým buňkám nebo infekčním agens • Uvolnění genetických produktů z buněk na vzdáleném místě (myoblasty sekretují do krve)

16. Genetický transfer • Ex vivo • Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) • In vivo • Transfer se děje přímo do tkáně pacienta. Pomocí liposomů nebo virových vektorů.

18. Principy genetického transferu • cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce genu se děje • A) do chromozomu • gen se bude rozšiřovat do dalších buněk • zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky) • náhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo. • B) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého dlouhodobého účinku

34. Haplotypes I and II within the genes encoding (a) interferon (IFNG) and (b) interleukin 4 (IL4)

35. Relationship between IFNG genotype and IFN- expression levela

36. Potential scenario for the implementation of cytokine genetics in future strategies for the treatment of multifactorial diseases

37. Schematic diagram of Ad5 virion. The double-stranded DNA genome is packaged within an icosahedral protein capsid. The major structural protein of the capsid is the hexon. Penton capsomers, formed by association of the penton base and fiber, are localized at each of the 12 vertices of the Ad capsid.

38. The pathway of adenoviral infection

39. Retargeting of adenoviral vectors by bispecific conjugates. • Ad attachment to cells is accomplished by the high affinity binding of the knob • domain of the fiber to the primary cellular receptor, CAR. • (B) The bispecific conjugate is designed to simultaneously ablate • native tropism, by preventing the Ad vector from binding to CAR, and introduce • novel tropism, by directing the vector to a novel target receptor on the cell surface.

40. Schematic diagram of fiber-pseudotyped vector. The fiber-pseudotyped vector is constructed by substituting the fibers from an Ad2 or Ad5 vector backbone with the fiber proteins from an alternative serotype.

41. Scheme of HLA-restricted immune response against cancer. Peptide-loaded mature dendritic cells can prime naïve T cells, which become activated effector cells able to recognize and kill tumor cells expressing the peptide/MHC complex. Tumor cells and regulatory T cells (the latter characterized by the co-expression of CD25 and CD4) can produce immunosuppressive factors that may inhibit both the maturation of dendritic cells, and the activation of T cells

42. Interaction between innate immunity cells (NK cells, macrophages) and HLA-restricted immunity against tumor. NK cells can facilitate adaptive immune response by increasing the availability of TAA and danger signal mediators in the tumor microenvironment, thus favoring dendritic cell maturation. This would lead to enhanced priming of T cells, which ultimately sustains an effective HLA-restricted immune attack against cancer cells. NK cell activity can be impaired by ROS, which are produced by macrophages present in the tumor microenvironment. Some substances (e.g. histamine and IL-10) inhibit ROS production by macrophages, thus stimulating NK cell function.

43. Specific pathophysiology of a gene therapy side effect

44. Factors that regulate acute secretion of insulin from cells

45. Antisense therapeutics in cancer trials

46. Figure 1. Schematic representation of transcriptionally targeted gene expression. Tissue- or cancer-specific promoter-driven reporter or therapeutic gene is incorporated into a gene delivery vector (depicted as recombinant adenovirus here). Gene transfer can occur in both targeted cancer cells and non-targeted normal cells. However, transgene expression can only occur in cancer cells due to the presence of transcription factors competent to mediate expression of the specific promoter. Red squares denote the endogenous gene product expressed from the specific promoter. The swirls denote the reporter/therapeutic gene product.

49. Figure 2. Binary approaches to amplify activity of weak promoter. (a) Two-step transcriptional amplification. The specific promoter drives expression of a synthetic transcriptional activator, GAL4-VP16, which in turn binds to and activates the GAL4 responsive promoter of the reporter or therapeutic gene. Multiple GAL4-VP16 activators work in concert to synergistically activate transcription of the downstream gene (denoted by upward sweeping arrow). (b) Cre-mediated activation of gene expression. Cre recombinase expression is regulated by a tissue- or cancer-specific promoter. Activation of transgene expression is induced by removal of the translational inhibition sequence via a Cre-specific recombination between the two loxP sites.