Giriş

2. Giriş • Pulmoner fibrosis kronik inflamatuvar hastalıktır • Prognozu ve tedaviye cevabı kötüdür • Patogenezi tam olarak bilinmemektedir. • Oksidatif ve nitrozatif stresin rolü üzerinde durulmaktadır. Gross TJ.N Engl J Med 2001 16; 345: 517-525. Weissler JC. Am J Med Sci 1989; 297: 92-104.

3. Giriş • Son zamanlarda astım, İPF, bronşektazi gibi hastalıklarda nitrik oksitin rolünü araştıran çalışmalar yayınlanmaktadır. • NO, ortamda O2- radikali varlığında süratle ONOO- radikaline dönüşür. • ONOO- kuvvetli bir radikaldir. Lipit, amino asit ve protein peroxidasyonuna neden olur. • Dokuda proteinlerin yapısında bulunan tirozin ile birleşerek nitrotirozin oluşturur ve proteinlerin yapısını bozar. Eynott PR, Eur J Pharmacol 2002; 452: 123-133. Paredi P.Am J Respir Crit Care Med 2002; 166: S31-37. Kharitonov SA, Eur Respir J 2003; 21: 433-438. Paredi P. Chest 1999; 115: 1352-1356.

4. Bleomisin maruziyeti İnflamasyon Nötrofil ve makrofaj Bleomisin Fe kompleksi ROS üretimi O2- , H2O2, OH-. NO yapımı ONOO- Endotel hasarı Fibroblast aktivasyonu Kollajen sentezinde artma Söğüt S. Eur J Pharmacol 2004;494:213-220 den alınmıştır Akciğer fibrozisi

5. Giriş • Aminoguanidin spesifik iNOS inhibitörüdür. • Nitrik oksit sentezinin inhibisyonun bleomisine bağlı akciğer fibrozisini önleyebileceği gösterilmiştir. Gurujeyalakshmi G.Nitric Oxide 2000; 4: 399-411. Misko TP. Eur J Pharmacol 1993; 233: 119-125. Giri SN.Nitric Oxide 2002; 7: 109-118. Chen XL. Acta Pharmacol Sin 2003; 24: 697-702.

6. Giriş • Antioksidan maddelerin de bleomisin fibrozisini önleyebileceği gösterilmiş. • Antioksidan ilaçlarla aminoguanidinin bu konudaki etkilerini karşılaştıran çalışma mevcut değildir. • Ayrıca dokuda ONOO- ‘in oluşturduğu nitrotirozin üzerine aminoguanidinin nasıl etki ettiği bilinmemektedir. Ozyurt H, Clin Chim Acta 2004; 339: 65-75. Hoshino T. Am J Respir Crit Care Med 2003; 168: 1075-1083. Sogut S, Eur J Pharmacol 2004; 494: 213-220. Serrano-Mollar A, Br J Pharmacol 2003; 138: 1037-1048.

7. Deney hayvanları • 35, 12 haftalık, ağırlığı 250-300 gr olan erkek Sprague-Dawley cinsi sıçanlar kullanıldı. • Isı, ışık ve nemi uygun ortamda tutuldu. • Blm-fibrozis modeli önceden tanımlanan 2.5 U bleomisinin tek dozda trakea için verilmesi ile yapıldı. • Sıçanlar 14 gün sonra kanatılarak öldürüldü ve diğer işlemler yapıldı. • Fibrozis, doku hyroksiprolin düzeyi ölçümü ve histopatolojik yöntemle değerlendirildi.

8. Erdosteine ve aminoguanidin bleomisin verilmesinde bir gün önce başlandı.

9. BAL • Genel anestezi altında trakeal kanül ile 4 ml SF 4 kez verildi. Toplam 16 ml. • Önce düşük devirde santrifüj yapıldı. • Dipte kalan hücreler tekrar 0.5 ml sıvı ile karıştırıldı. • Hemositometre ile lökosit sayıldı • Kalan sıvıdan sitospin yapıldı ve Giemza ile boyandı. 300 hücre sayılarak makrofaj, nötrofil ve lenfosit yüzdeleri belirlendi.

10. Histolojik değerlendirme • Akciğerler %10 formalinle şişirildi ve 24 saat formalinde bekletildi. • Rutin işlemlerden sonra deney gruplarında haberi olmayan patolog tarafında Ashcroft kriterlerine göre değerlendirildi. • Grade 0: Normal akciğer • Grade 1: Alveol veya bronş duvarında minimal kalınlaşma • Grade 2-3: Akciğer yapısı normal, alveol duvarında orta derecede kalınlaşma • Grade 4-5: Akciğer parankim yapısının bozulması ve artmış fibrozis, fibroz bantlar ve küçük fibrozis kitleleri • Grade 6-7: Akciğer yapısının ciddi bozulması ve büyük fibrozis alanları • Grade 8: Total fibrozis Ashcroft T, J Clin Pathol 1988; 41: 467-470.

11. İmmunhistokimya • Üretici firmanın tarifine göre yapıldı. • 6 mikron kalınlığındaki kesitler deparafinize edildi. • Çeşitli işlemlerden sonra fare anti-nitrotirozin antikorları ile enkübe edildi. • Daha sonra çeşitli aşamalardan geçirilerek incelendi. (Calbiochem, Darmstadt, Germany)

12. Antioksidan enzim analizleri • Total (Cu-Zn ve Mn) SOD Sun ve arkadaşlarının yöntemine göre ölçüldü. • GSH-Px Pagia ve Valentin yöntemine göre ölçüldü. Sun Y, Clin Chem 1988; 34: 497-500. Pagia ve Valentine.J Lab Clin Med 1967; 70: 158-170.

13. NO, MDA, MPO ve HP analizleri • NO hemen nitrat ve nitrite dönüştüğü için nitrit ve nitrat düzeyleri NO üretimini yansıtmaktadır. Gries reaksiyonu esasına göre ölçüldü. • MDA Wasowitcz’s yöntemiyle ölçüldü. • MPO analizi spektrofotometrik olarak ölçüldü. • HP Wossner metodu ile ölçüldü. Cortas NK. Clin Chem 1990; 36: 1440-1443. Wasowicz W.Clin Chem 1993; 39: 2522-2526. Wei, H.Carcinogenesis 1993; 14: 1195-1201. Woessner JB. Arch Biochem Biophysics 1961; 93: 440-447.

14. İstatistik • Veriler ortalama ± standart hata olarak verildi. • Ortalamalar varyans analizi (ANOVA) ve daha sonra uygun post hoc test (LSD) ile karşılaştırıldı. • İşlemler SPSS programı ile yapıldı. • P< 0.05 anlamlılık düzeyi olarak kabul edildi.

15. BAL analizi sonuçları *: p < 0.05 diğer gruplara göre, #: p < 0.05 kontrol grubuna göre

16. Oksidatif stres belirteçleri

17. Oksidatif stres belirteçleri

18. Oksidatif stres belirteçleri

19. MPO analizi

20. NO analizi

21. Akciğer fibrozisi * p < 0.001 kontrol grubuna göre, # p < 0.001 diğer gruplara göre

22. Histopatolojik bulgular BLM Kontrol

23. Kontrol BLM AMN

24. Kontrol BLM ERD

25. BLM Kontrol ERD+AMN

26. Anti-nitrotirozin antikorları BLM Kontrol

27. Anti-nitrotirozin antikorları BLM Kontrol AMN

28. Anti-nitrotirozin antikorları Kontrol BLM ERD

29. Anti-nitrotirozin antikorları BLM Kontrol ERD+AMN

30. Sonuç • Bleomisin bağlı fibrozis oluşmasında tirozin nitrasyonunun rolü vardır. • Aminoguanidin nitrik oksit sentezini ve dolayısıyla tirozin nitrasyonunu oluşmasını engeller ve bu yolla fibrozis gelişmesini önler. • Erdostein de antioksidan etkiye ilaveten tirozin nitrasyonu inhibisyonu yolluyla bleomisine bağlı akciğer fibrozisini önler. • Erdostein ile aminoguanidinin kombine edilmesi ilave fayda sağlamaz.