S PERM VE TEST İS DOKUSU DONDURULMASINDA ÖNEMLİ NOKTALAR

1. SPERM VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASINDA ÖNEMLİ NOKTALAR Doç.Dr. M. Ertan Kervancıoğlu

2. Sperm ve Testis Dokusu Dondurma Endikasyonları • Nesil ıslahında • Kemoterapi sonrası fertilitenin sağlanması • Fertilitenin garantiye alınması • ICSI için yapılan TESE den artan örnekler • Soyu biten hayvanların çoğaltılmasında

3. Fare spermi ICSI için, 800 mOsmol KSOM-BSA medyumu içinde oda ısısında 1 hafta ve -20 derecede 3 aya kadar saklanabilmektedir Thuan et al 2005

4. TARİHÇE • Karda sperm dondurdu (Spallazani ve ark. 1776) . • Gliserol freezingde kullanıldı (Polge ve ark. 1949). • Kuru buzda sperm basarılı donduruldu (Bunge ve Sherman 1953). • Sıvı Azotta sperm başarılı donduruldu (Sherman ve ark. 1963). • Dondurulup çözülmüş testiküler sperm ICSI de kullanıldı (Romero 1996).

5. PERMEATING Dimethyl Sulfoxid Propilen Glikol (PROH) Gliserol Ethylene Glikol NON- PERMEATING Sukroz Rafinoz Glisin CRYOPROTEKTANLAR

6. DONDURMA Azot Buharı Komputer Kontrollu Vitrifikasyon ÇÖZME Hızlı Komputer Kontrollü

8. Bir hücrenin dondurmaya hassasiyeti boyutuna, hidratasyon durumuna, membran geçirgenliğine ve siklus fazına bağlıdır.

9. FREEZİNG ETKİNLİĞİ Motilite tayini Plasma membranındaki hasar Akrozomal hasarlar Biokimyasal markerler Fertilite sağlanması

11. Chang HS et al 2008

14. De Paula et al 2006

15. Normospermik ve oligospermik sperm 3 defa dondurulup çözülebilir. Hareketli, normal ve canlı sperm elde etmede • Yavaş veya hızlı dondurma • Yıkanmış veya yıkanmamış semen dondurma • Yıkanmış ve seminal plasma eklenmiş arasında anlamlı bir fark yoktur. Bondularatne ve Bongso 2002

16. Spermin seminal plasma ile beraber dondurulmasında çözme sonrası motilite ve DNA bütünlüğü daha iyi korunur. Donnelly ve Ark. 2001

18. Borini ve Ark. 2000

19. TG SCHUSTER et al 2003

20. Cryoprotectant-Free Cryopreservation of Human Spermatozoa by Vitrification and Freezing in Vapor ISACHENKO ET AL 2004

21. Verheyen G 2004

22. Verheyen G 2004

24. Fertiliteyi koruma yöntemlerinde onkoloğun görevi • İnfertiliteyi tedevinin potensiyel bir riski olarak hastanızla tartışın. • Fertiliteyi koruma işlemlerinin kanser terapisinin başarısını düşürmesi, maternal yada perinatal komplikasyonları artırması ve bebeğin sağlığını tehlikeye atacağı ile ilgili temel cevapları verin. • Hastaları üreme uzmanları psikolojik danışmanlara yönlendirin.

25. Sperm cryopreservation in oncological patients:a 14-year follow-up study

26. Her sene 4000 çocuk steril olmalarına sebep veren kanser tedavisi görüyor Yılda ortalama 15 ile 35 yaş arası 9100 erkeğe testis kanseri, Hodgkin’s lenfoma ve lösemi teşhisi konuyor

27. Testis hücre karışımının uzun bir süre için dondurabileceği ve çözülmesi sonrası spermatogenezisi başlatabileceği gösterildi Avarbock ve Ark 1996

28. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Brinster et al (1994- 2003)

29. Transplantasyonda genellikle her testis için 10 mikrolitrelik hacim kullanılır. Tavsiye edilen hücre yoğunluğu 10 000 000/ml hücredir. Yaklasık olarak transplante edilen hücrelerin % 10 u kolonize olur.

30. Spermatogenezis lateral olarak tubul içinde her iki yöne doğru ilerler ortalama ilerleme hızı 55-60 mikron/gun. Transplantasyondan yaklasık 1 ay sonra spermatosit kolonileri, 2 ay sonra olgun spermatozoon 3 ay sonrada testisin % 30 unda spermatogenez gözlenmektedir.

31. Germ hücre transplantasyonu için hazırlanan testis dokusunun kriyoprezervasyonunda uygun tekniğin araştırılması Doç.Dr.E.Kervancıoğlu Dr.A.Arvas Doç.Dr.S.Solakoğlu Dr.O.Karabulut

32. Hücre izolasyonu • HBSS içine %10FCS,2mM glutamine,6mM lactate,0,5mM pyruvate ile ana solusyon hazırlandı. • Testisler 1mg/ml collegenase tipIV içinde 37 C da 15 dakika bekletildi. • 7mg/ml DNAse içeren solusyondan üzerine eklenerek tübüller ayrıldı ve daha sonra HBSS içinde yıkandı. • %0.25 trypsin ve 1 mM EDTA Tübüllerin üzerine eklendi ve 37 C da 10 dakika bekletildi.Üzerine enzimin işlevini durdurmak üzere 1 ml FBS eklendi. • Hücreler yıkandıktan sonra 50 milyon/ml hücre olacak şekilde resüspanse edildi.

33. Germ hücrelerinin dondurulması ve çözülmesi • Kryoprotektan olarak DMSO ve Glyserol kullanıldı. • 1.Dondurma metodu -70 C da 12 saat sonrası sıvı nitrojene alındı. • 2.dondurma metodu Planer Kryo 10 da embryo freezing programı uygulandı. • 1.çözme metodu 37 C da çözülüp,üzerine 3 kat ana solusyondan eklendi.500Xg de santrfüje edilip,resüspanse edildi. • 2.çözme metodu oda ısında çözülüp üzerine 1 ve 0,5 M dilüe solusyonlar ile 5 er dakika yıkandı,500Xg de santrifüje edilip,resüspanse edildi.

37. Keros et al 2005

38. Keros et al 2005

40. Honaramooz, A. et al. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature, 418, 778 - 81 , (2002).

41. SAKLAMA SÜRESİ • Metabolik prosses yavaştır • Akkümüle kozmik radyasyon • Geçici ama tekrarlayan ısı değişiklikleri

42. PROBLEMLER • Bir donorden dört alıcının HIV enfeksıyonu (1980) • Kemik iliği transplantında 6 hastada Hepatit B (1995)

43. TEMİZLİK • Tankların rutin temizliği • Soğutucu aletlerin temizliği • Gametler için uygun temizleyici • Kaçaksız straw

44. Uyguladığımız Protokol • Ağzı vidalı ependorf freezing tüpünde • Etiketleme için özel kalem • Normal ve oligospermik örnekte glyserol ile klasik freezing • NOA önce semen alıp seminal plasma içerisinde doku ve sıvı ayırarak • Testiculer doku DMSO ile • Çözme semen oda ısısında

45. SONUÇ SEMEN VE TESTİS DOKUSU DONDURULMASI MATERYAL BULUNMASI VE ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASININ KOLAY OLMASI DOLAYI İLE HER LABORATUARIN KENDİNE GÖRE BİR PROTOKOL HAZIRLAMASI GEREKMEKTEDİR.