Imobilizace a stabilizace enzymů

Imobilizace a stabilizace enzymů

Použití rozpustných enzymů Nevýhody • Jednorázová aplikace • Nízká stabilita rozpustného enzymu • Značně drahé Možné řešení • Imobilizace enzymu

Imobilizace enzymů • Definice: enzymy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti za zachování jejich enzymové aktivity, a které mohou být použity opakovaně a kontinuálně

Imobilizace enzymů • Imobilizace je proces, který převádí rozpustný biopolymer (enzym) na formu nerozpustnou nebo oddělenou  většinou tvorba heterogenního biokatalyzátoru • Vazba na pevný nosič, zabudování do (bio)polymeru, vazba na membrány, zesítění... • Zvýšení stability imobilizovaného enzymu • Odpadá náročná izolace produktu (z heterogenní směsi je možno získat produkt po filtraci, centrifugaci ....) • Imobilizovaný enzym je možno použít opakovaně • Enzymové procesy mohou být prováděny kontinuálně • Imobilizace může pozitivně ovlivnit stabilitu enzymu

Imobilizace enzymů • Podmínka úspěšného použití imobilizovaných enzymů  dostatečný kontakt reaktantů s katalyzátorem • Nejčastější uspořádání  reaktant (a následný produkt) je ve vodné fázi, která prochází přes pevnou fázi obsahující katalyzátor • Existují případy, kdy je reaktant ve fázi plynné nebo v kapalné fázi, která je nemísitelná s vodou

Metody imobilizace Vazba na pevné nosiče – požadavky • Velký povrch • Hydrofilní charakter • Nerozpustnost • Chemická, mechanická a teplotní stabilita • Vhodný tvar a velikost částic • Odolnost proti mikrobiálnímu působení • Možnost opakovaného použití

Vazba na pevné nosiče • Fyzikální adsorpce – nejstarší metoda imobilizace (1916 – invertasa na alumině)  často dochází k uvolňování enzymů • Vazba na ionexy (nutná volba optimálního pH pro navázání) • Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny

Příklad kovalentní imobilizace • Nosič nesoucí aminoskupiny, aktivace glutaraldehydem, vazba enzymu přes aminoskupinu

Skupiny v molekulách proteinů využitelné pro kovalentní imobilizaci • -NH2 (N-koncová, ε-NH2 lysinového zbytku) • -COOH (C-koncový, β-, γ- COOH asparagové a glutamové kys.) • -SH cysteinu • -OH serinu a tyrosinu • cyklický systém tyrosinu a histidinu

Oxidace polysacharidů • Polysacharidová matrice oxidovaná jodistanem • Reakce s aminoskupinou proteinu

Epoxidová metoda • Reakce polysacharidové matrice (celulosa, agarosa, dextran) s epichlorhydrinem  tvorba glycidového derivátu (obsahuje oxiranový kruh) • Reakce s NH2, SH skupinou enzymu

Orientovaná a náhodná imobilizace

Zesítění • Reakce molekul enzymů s bifunkčním činidlem (např. glutaraldehyd) • Navázání aminoskupin patřících k různým molekulám enzymu  zesítění  tvorba nerozpustného produktu

Zabudování enzymů • Zabudování enzymů do struktury (bio)polymerního gelu • Zabudování enzymů do polopropustné membrány

Zabudování enzymů do gelu Používané gely • Polyakrylamid • Alginát (Na+ forma je rozpustná  převod do nerozpustné Ca2+ formy) • Karrageenan (jednomocné ionty (např. K+) způsobí převod do nerozpustné formy) • Agarosa (tekutá při 45 – 50 °C), převod do nerozpustné formy ochlazením • Želatina (převod do nerozpustné formy zesítěním glutaraldehydem)

Zabudování enzymů do membrán • Umístění enzymu do fyzikálně odděleného prostředí  mezi semipermeabilní membrány • Výhoda  použití enzymů v nativním stavu • Dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltrační membrány

Imobilizace na magnetické nosiče • Magnetické nosiče  polymerní částice obsahující magnetické oxidy železa, silanizovaný magnetovec • Příprava podobná jako v případě nemagnetických nosičů • Výhoda  možnost práce v suspenzních systémech, po skončení enzymové reakce je možné odstranění imobilizovaného enzymu pomocí magnetického separátoru (všechny ostatní složky jsou diamagnetické)

Zesítěné enzymové krystaly a agregáty • Příprava krystalů enzymů, následné zesítění glutaraldehydem • Precipitace proteinů (enzymů) vhodným činidlem  tvorba proteinových agregátů  následné zesítění glutaraldehydem

Stabilizace enzymů • Enzym zůstává v rozpustné formě, váží se různé vysokomolekulární sloučeniny • Vazba polysacharidů (např. dextranu) na molekuly enzymů  tvorba umělých glykoproteinů (glykoproteiny jsou obvykle stabilnější než neglykosylované proteiny) • Přídavek nízko- nebo vysokomolekulárních látek do prostředí (anorganické ionty, polyethylenglykol, polyoly ...)

Aplikace imobilizovaných enzymů • Použití imobilizovaných enzymů pro provedení specifických reakcí ve vhodných reaktorech • míchané reaktory • plněné kolony • fluidní lože • ultrafiltrační membránové systémy • Použití při přípravě antibiotik, steroidních látek, specifických aminokyselin

Imobilizace a nanotechnologie • Zabudování enzymů do nanopórů vhodných nosičů • Stabilizace pomocí iontových interakcí • Takto zabudované enzymy jsou velmi stabilní po dlouhou dobu J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11242−3

Imobilizace a stabilizace enzymů