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Cromatografia Liquida - CLAE

Cromatografia Liquida - CLAE. UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz. O que é Cromatografia ?. Definição: A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária.

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Cromatografia Liquida - CLAE

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Presentation Transcript

  1. Cromatografia Liquida - CLAE UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz

  2. O que é Cromatografia ? • Definição: • A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária. • A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .

  3. O que é Cromatografia a Líquido HPLC? • Definição: • Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido . • O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

  4. Instrumentação para HPLC

  5. CLAE -HPLC Fase móvel (amostra) Fase estacionária (Componentes retidos) Migrações diferenciais Analitomov⇋ Analitoest K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição

  6. INSTRUMENTAÇÃO MIXER detector column injector oven pump One pump used to control 4 reservoirs; mixing is done before pump. data processor Fase móvel

  7. Instrumentação para HPLC FM COLUNA DETECTOR PURGA INJETOR BOMBA

  8. Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais : • Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel ; • Coluna cromatografia : É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ; • Detector : É o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas

  9. Componentes auxiliares de um HPLC Bomba : • É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente ); • É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas. • Fornece uma alta pressão.

  10. BOMBA • Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min) • Opções: Simples, gradiente binário, quaternário • Mede a pressão sobre o sistema • Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)

  11. Componentes auxiliares de um HPLC Válvula de purga: • É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: • É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição .

  12. Fase estacionária

  13. Colunas Cromatográficas Fases estacionárias : • Sílica- C8 • Sílica- C18 • Sílica- C18 ( ODS) • Sílica- NH2 • Sílica- Diol • Sílica • Troca Iônica • Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca • Resinas DVB-ST porosas • Pré-Coluna: • É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica . • Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.

  14. COLUNAS CROMATOGRÁFICAS • SÍLICA (suporte + usado): • Resistência mecânica • Variedade de forma, tamanho de partículas e poros • - Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas • - Superfície não homogênea

  15. SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS LIVRES GEMINAL VICINAIS influenciam no grau de acidez da sílica

  16. Fase Estacionária • A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. • São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. • Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

  17. MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL - QUIMICAMENTE LIGADAS - HÍBRIDAS - RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS

  18. Fases Quimicamente Ligadas C8 média C18 (ODS) amostra forte C4 amostra fraca amostra

  19. POLIMÉRICAS Pré-hidrólise do agente silanizante - Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento

  20. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS Matriz orgânica-inorgânica (RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O  SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH Tetraalcoxissilanoalquiltrialcoxissilano - Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais - Menor quantidade de grupos de silanóis - Ultra-fast cromatografia

  21. RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS • RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA • - SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS

  22. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte - Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) • Poli(etileno) • Poli(butadieno) • Poli(estireno) • Poli(dimetilsiloxano) • Poli(metiloctilsiloxano) • Poli(metiloctadecilsiloxano) • Poliéteres • Polissacarídeos • Poliaminas • Polinucleotídeos • Poliamidas • Proteínas Sílica Zircônia Titânia Alumina

  23. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO) INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

  24. Si Si Si Fases estacionárias Interações van der Waals C8 PH van der Waals C2 van der Waals

  25. O H Si C N H N Si H O H Si O O O H H H O Fase Estacionária Interações Fases estacionárias CN Dipolo/Dipolo Ligação de hidrogênio NH2 Ligação de hidrogênio 2OH

  26. + H N 3 - Si SO 3 + H N 3 O - Si O - O S 3 + Si N (CH ) 3 3 Fase Estacionária Interações Fases estacionárias Eletrostática PRS CBA Eletrostática Eletrostática SAX

  27. Processo de Eluição Definição: • Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária. Série eluotrópica • Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

  28. Força eluente: • É uma medida da energia de adsorção do solvente Cromatografia com fase normal: • Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar. Cromatografia com fase reversa: • Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.

  29. DETECTORES - Classificação Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.

  30. DETECTORES POLARÍMETRO UV MS IR ELETROQUÍMICO FLUORESCÊNCIA

  31. Detectores Ultra violeta: • É mais comum, usado na CLAE. • Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta. • São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.

  32. Ultra violeta (UV-visível): • Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. • Seletivo (moléculas com cromóforos) • Comprimento de onda (λ) fixo • λ pode ser selecionado (190 – 600 nm) • Varredura (DAD) • Solventes também absorvem Solvente λ nm 190 210 200 330 200 245 215 Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF

  33. Fluorescência: • Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV • Seletivo (moléculas que fluorescem) • Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas • Mais sensível que UV por ser emissão • Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente. • Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila

  34. Detectores por Índice de Refração:

  35. Indice de refração: • Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna • Não- seletivo • Sensível a variações de: • Temperatura • Pressão • Fluxo • Composição fase móvel • Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar • Muito usado em cromatografia preparativa

  36. Espectrometria de massas: • Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z) • Destrutivo • Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS) • Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI • Análise de micro e macromoléculas. • Alta sensibilidade

  37. MODOS DE SEPARAÇÃO • NORMAL • REVERSO • TROCA IÔNICA

  38. MODO NORMAL MECANISMO DE INTERAÇÃO: ADSORÇÃO Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel Fase móvel: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino

  39. MODO REVERSO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA HIDROFOBICIDADE Fase estacionária: APOLAR Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO

  40. Tempo de Retenção e Hidrofobicidade OH C18 (ODS) Interação fraca forte OH

  41. Hidrofobicidade • Se a amostra possui • CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica • : grupo aromático • Se a amostra possui • -COOH : grupo carboxílico • -NH2 : grupo amino • -OH : grupo hidróxi • A hidrofobicidade será forte • A hidrofobicidade será fraca

  42. TROCA IÔNICA MECANISMO DE INTERAÇÃO : ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico

  43. Microsseringas para Injeção LÍQUIDOSCapacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L agulha (inox 316) êmbolo corpo (pirex) Obs: Seringa de HPLC

  44. Seqüência • Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos • Condicionamento da coluna com fase móvel • Monitoramento da linha de base • Injeção das amostras

  45. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS FATOR DE RETENÇÃO (k) FATOR DE SEPARAÇÃO () NÚMERO DE PRATOS (N)

  46. tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) Cromatograma tR SINAL tM TEMPO

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