290 likes | 804 Views
DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI. Enrico Tortoli. La tubercolosi. nel MONDO 2.000.000 morti all’anno 8.000.000 nuovi casi all’anno 1/3 della popolazione mondiale infettato in ITALIA 4.287 casi notificati nel 2001. Infezione da M. tuberculosis. Malattia tubercolare
E N D
DIAGNOSI IMMUNOLOGICA DELLA TUBERCOLOSI Enrico Tortoli
La tubercolosi • nel MONDO • 2.000.000 morti all’anno • 8.000.000 nuovi casi all’anno • 1/3 della popolazione mondiale infettato • in ITALIA • 4.287 casi notificati nel 2001
Infezione da M. tuberculosis • Malattia tubercolare • se il sistema immunitario non riesce a controllare l’infezione • Infezione latente (assenza di malattia) • se l’infezione rimane sotto il controllo del sistema immunitario
M. tuberculosis, infezione Esposizione al M. tuberculosis Assenza di infezione (5%) TBC attiva (5%) (entro 2 anni) Infezione (95%) Riattivazione (5%) TBC latente (95%) nessuna riattivazione (90%)
Risposta immune all’infezione tubercolare Risposta ICM Moltiplicazione batterica Anticorpi Tempo infezione malattia
I linfociti T • Cellula-T nativa = non venuta in contatto con l’Ag • Cellula-T effettrice = cellula-T nativa venuta in contatto con l’Ag • Cellula-T memoria = cellula effettrice dopo l’allontanamento dell’antigene • Cellula-T effettrice = cellula-T memoria in occasione di un nuovo contatto con l’Ag
La Mantoux • Introdotta nel 1890, è il più vecchio test diagnostico ancora in uso • Si basa sull’inoculo intradermico del PPD, (miscela di antigeni del M. tuberculosis, alcuni dei quali sono presenti anche nel BCG e nei micobatteri non tubercolari)
Mantoux Linfocita T Cellula presentante l’Ag Rilascio di IFN-, TNF e IL8 richiamo e attivazione cellulare indurimento e arrossamento nel punto dell’iniezione
Punti di forza della Mantoux • Utile per predire la TBC attiva • Il trattamento dei soggetti Mantoux-positivi riduce drasticamente il rischio di passaggio alla tubercolosi attiva • Basso costo • Non richiede l’intervento del laboratorio
Limiti della Mantoux • Falsi positivi • 5-60% dei vaccinati • Tempo trascorso dalla vaccinazione • Numero di vaccinazioni • Età al momento della vaccinazione - Esposizione a micobatteri non tubercolari (NTM) - Effetto booster • Anergia (soggetti immunodepressi, malnutriti, con tubercolosi avanzata) • Falsi negativi • Errori di inoculo • Errori di lettura (soggettività, inaccuratezza della misurazione) • Problemi di ordine pratico • Doppia presentazione del paziente • Mancata lettura nel 30% dei casi
Produzione di interferone- (IFN-) • L’infezione tubercolare stimola la risposta della cellule T • Le cellule-T attivate secernono citochine • IFN- • TNF • IL8 • Le cellule-T effettrici producono IFN- entro poche ore dalla stimolazione • Le cellule-T memoria devono prima proliferare trasformandosi in cellule effettrici, non sono quindi in grado di produrre IFN- prima di 24h • L’IFN- non è normalmente presente in circolo, è stabile e misurabile
I test basati sull’interferone-γ • I linfociti del soggetto in esame vengono posti in contatto con l’antigene, con un controllo negativo privo di antigene e con un controllo positivo contiene fitoemoagglutinina • Ricerca dell’IFN-γdopo opportuna incubazione • assenza di IFN-γ= ASSENZA DI INFEZIONE • presenza di IFN-γ= INFEZIONE • presenza di IFN-γnel controllo NEG = TEST NON VALIDO • assenza di IFN-γnel controllo POS = DEFICIT IMMUNITARIO
La scelta degli antigeni • I linfociti T dei soggetti con infezione tubercolare producono interferone-γse vengono in contatto con uno o più antigeni del M. tuberculosis • PPD (purified proteic derivative) • ESAT-6 (early secretory antigenic target 6) • CFP-10 (culture filtrate protein 10) • ESAT-6 e CFP-10 sono codificati in una regione genica (RD1) che manca nel BCG e in quasi tutti i MNT
NTM Antigeni Antigeni ESAT-6 CFP-10 EAST-6 CFP-10 M abscessus - - M tuberculosis + + M avium - - Ceppi BCG gothenburg - - M branderi - - moreau - - tice - - M celatum - - tokyo - - danish - - glaxo - - M chelonae - - montreal - - pasteur - - M fortuitum - - M gordonae - - M intracellulare - - M kansasii + + M malmoense - - M marinum + + M genavense - - M scrofulaceum - - M smegmatis - - M szulgai + + M terrae - - M vaccae - - M xenopi - - Specificità di ESAT-6 and CFP-10
COLORE Metodo ELISA K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Incubazione overnight a 37oC Se sono presenti cellule-T effettrici viene secreto IFN-g Sangue eparinato Trasferimento in pozzetti e aggiunta dell’antigene DO 450nm IFN-g IU/ml Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura
COLORE Metodo ELISA in-tube Raccolta del sangue in provette eparinate Incubazione per 16-24h a 37°C K neg ESAT6 + CFP10 mitogeno centrifugazione DO 450nm Recupero del plasma e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) IFN-g IU/ml Lavaggio, aggiunta di substrato e lettura Misura della DO e dosaggio dell’IFN-g contro una curva di taratura
COLORE Metodo ELISpot K - ESAT-6 CFP-10 Mitogeno Separazione e conteggio dei leucociti mononucleati Sangue eparinato Trasferimento dei linfociti (250.000 cell.) in pozzetti coated con Ab anti-IFN-γ e aggiunta dell’antigene Conteggio degli spot, al microscopio o con lettore automatico Lavaggio e dosaggio dell’IFN-γ (‘sandwich’ ELISA, incubazione 120 min) Incubazione overnight a 37oC
Metodo ELISpot: lettura • Man mano che una cellula secerne IFN-γ questo viene legato dagli Ab sottostanti, si forma quindi uno spot • POSITIVO: quando si hanno spot con almeno uno degli antigeni • se il K- ha 0-4 spot ed il pozzetto dell’Ag ha più di 5 spot • se il K- ha >5 e <10 spot ed il pozzetto con l’antigene ha un numero di spot almeno doppio • NON VALIDO se K- >10 spot e/o K+ <20 spot
Vantaggi dei metodi basati su IFN- • Test in vitro • Nessun effetto booster • Specificità elevata • Non influenzati dalla vaccinazione con BCG • Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non è richiesta la collaborazione del paziente • Interpretazione oggettiva • Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari
Valutazione clinica dei test basati su IFN- • Non esiste un gold standard per la tubercolosi latente • La sensibilità del test viene solitamente stimata in soggetti con tubercolosi attiva, usando la coltura come gold standard • La specificità viene solitamente stimata in soggetti ad alto rischio
La risposta IFN- ad ESAT-6/CFP-10 è predittiva del passaggio a TBC attiva? • La risposta IFN- correla con l’esposizione • Circa il 90% dei pazienti risponde • In Etiopia, un follow up di 2 anni di contatti conviventi col caso indice, ha dimostrato la correlazione della risposta ad ESAT-6 (ma non al PPD) con la progressione verso la malattia • Doherty et al (JCM 2002)
Correlazione IFN-γ/Mantoux • Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004
Test IFN-γ vs. Mantoux • Sensibilità relativa ai casi di TBC attiva: SOVRAPPONIBILE • Sensibilità nei casi di sospetta infezione latente: MAGGIORE per IFN-γ • I casi con Mantoux NEG e IFN-γPOS sono generalmente associati con l’esposizione • I casi con Mantoux POS e IFN-γNEG non sono generalmente associati con l’esposizione
IFN-γ e gruppi di rischio AJRCCM, Mori, 2004
Studio dei contatti • Caso indice: uno studente di una scuola danese • Stratificazione dei contatti: • Soggetti che cantavano nello stesso coro del caso indice • Compagni di classe • Altri studenti della scuola • Forte correlazione della risposta IFN-γ con l’esposizione • Forte correlazione della Mantoux con la vaccinazione AJRCCM Brock , 2004
Studio dei contatti • Caso indice: una partoriente in un ospedale italiano • Stratificazione dei contatti: • Ricoverate nella stessa stanza • Neonati • Visitatori • Positività al test a base di IFN- fortemente correlata con l’esposizione • Mantoux quasi sempre negativa AJRCCM Richeldi, 2004
Altri studi • Nessuna correlazione con la vaccinazione • Nessuna correlazione con le micobatteriosi • Nessuna variazione in corso di terapia • Alta riproducibilità • Maggior sensibilità negli immunodepressi
Da approfondire • Sensibilità negli immunodepressi • Sensibilità nei bambini • Sensibilità nella tubercolosi extrapolmonare • Utilità nel monitoraggio della terapia • Specificità nei pazienti con micobatteriosi
ATS: soggetti da testare • Soggetti con fibrosi polmonare • Soggetti provenienti da paesi ad alta endemia (in particolare se arrivati da meno di un anno) • Soggetti appartenenti a categorie sociali particolari (senza fissa dimora, carcerati) • Operatori sanitari • Contatti stretti (> 4h/settimana) di soggetti con tubercolosi • HIV-positivi • Soggetti con Mantoux-conversione recente (< 2 anni) • Pazienti affetti da silicosi, neoplasie ematologiche, tossicodipendenti, immunosoppressi