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TEMA 2 PURIFICACI N DE ENZIMAS

channery
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TEMA 2 PURIFICACI N DE ENZIMAS

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Presentation Transcript

    8. This flow chart is more simplified than the other one. What do you think? For “separation graphic” show image of the chromatographic apparatus instead of a box. Combine fractions box: Graphic of little tubes pouring into a bigger beaker. We need to fit in a short text block with a description of the steps in order using numbers to label the steps.This flow chart is more simplified than the other one. What do you think? For “separation graphic” show image of the chromatographic apparatus instead of a box. Combine fractions box: Graphic of little tubes pouring into a bigger beaker. We need to fit in a short text block with a description of the steps in order using numbers to label the steps.

    9. FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN

    15. Tamaño Diálisis (membranas semipermeables)

    16. Tamaño Ultrafiltracion Centrifugación en gradiente de densidad Gradientes continuos de sacarosa? tubo de centrifuga Los componentes de la mezcla se separan por: Peso Tamaño Densidad Forma

    17. Coeficiente de sedimentación S = M (1-V?) N f M: peso molecular V: Volumen espécifico ?: densidad de la solución N : numero de avogadro F: coeficiente de fricción Las proteinas migran de forma proporcional a este coeficiente

    18. Cromatografía de filtración Las columnas rellenas polimeros inertes Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

    19. Exclusión molecular

    21. Tarea La enzima pepsina y grupo de marcadores fueron eluidos de una columna de sephadex. Los volumenes de elución junto con los marcadores moleculares son los siguientes. Determina el peso molecular de la pepsina

    22. Solubilidad Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación Mantiene nativa a la proteina Redisolucion sin perdida de actividad

    23. Interacciones mencionadas dependen de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura

    24. Solubilidad-pH La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero ? pI Solubilidad es minina Ej: ?contenido de aa ácidos ?pI bajo (4-5)

    25. Solubilidad-pH

    26. Solubilidad-Fuerza iónica Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) aumenta con la [ sales] ? Salting in La solubilidad a alta fuerza iónica (mayor a 0.02 M) disminuye con la [sales] ? Salting out La alta [sal] elimina la esfera de solvatación de la proteína Las proteínas en H2O tienden a formar COMPLEJOS electrostáticos ? precipitan

    27. Solubilidad-Disolventes Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) Se usan en distintas proporciones  Bajan el poder de solvatación de las soluciones acuosas

    28. Solubilidad- Temperatura 0-40 oC >T > solubilidad. 40-50oC aumenta la inestab y DESNATURALIZAN (? solubilidad)

    29. Carga

    37. TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN Diseño de enzimas: La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese. Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula. Adición de colas de afinidad.

    38. Tarea Después de la extracción y purificación de una enzima microbiana, esta es muy poco estable para su uso industrial. ¿Qué piensas que se puede hacer para aumentar la estabilidad?

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