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Enzimas de Restricción

Enzimas de Restricción. Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé , phd UPR – Aguadilla. Objetivos. Al completar esta presentación los estudiantes podrán : Definir lo que son las enzimas de restricción Describir los criterios para su nomenclatura

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Enzimas de Restricción

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Presentation Transcript

  1. Enzimas de Restricción Biol 3306 – Lab de Genética JA Cardé, phd UPR – Aguadilla

  2. Objetivos • Al completarestapresentación los estudiantespodrán: • Definir lo que son lasenzimas de restricción • Describir los criteriosparasunomenclatura • Explicar los factoresqueafectan la actividad de estas. • Mencionaralgunasaplicaciones de importancia de estas. • Prepararunareacción de digestión de DNA con enzimas de restricción

  3. Introducción:Vectores • 70’s: se crean exitosamente las primeras moléculas recombinantes • Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos • Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células • Una vez en célula huésped, • se replica • produce varias copias idénticas del gene • se expresa • esto se le llama clonación.

  4. Introducción: vectores • Para clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene. • Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector • Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus • La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables • Ori • Secuencias marcador • MCS

  5. Vector

  6. Enzimas • Proteínas • Aceleranreaccionesquímicas • Reducen la E de activación • E + S  ES  E + P • Ejemplos • Proteasas • Lipasas • amilasas • Dehidrogenasas • Girasas • Ligasas • Peptidasas • NUCLEASAS

  7. Enzimas de restricción • Descubiertas 1970, Daniel Nathans • Cortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenas • Aisladas de bacterias, cientos • Función: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extraño (fagos) • Sistema de restricción/modificación • Restricción/Metilación • Nombre, quien la produce • EcoRI – Escherichiacoli (cepa RY13) • Hind II – Haemophilusinfluenzae • XhoI – Xanthomonasholcicola

  8. Enzimas de restricción: Palindrome? • Reconocenpalíndrome, específicas • Secuenciaque lee lo mismo en ambascadenas, en orientaciónopuesta • 5’3’ • 3’5’ • 4, 6, 8 bp • 1/256bp, 1/4096bp • Isoesquisomeros • ambiguos-(Py-Pu) • DNA learning center

  9. Enzimas de restricción: • Cortan el enlace fosfodiester • Blunts ends • Enzimacortasimétricamente, en sitiosopuestos en ambascadenas • Sticky or cohesive ends • - enzimacortaasimétricamente, un pedacito SS se extiendedesde el 5’ o desde el 3’ • 5’ overhangs • 3’ overhangs

  10. Enzimas de restricción: • Cuidados: • Caras, se vendenporunidades • Unidad: cantidad de enzimanecesariaparadigerir 1µg de DNA segúnlascondiciones del fabricante • Sensitivas al calor • -20oC o hielosiempre • Contaminacióncruzada • Pipeteo: puntanuevasiempre!!!

  11. Enzimas de restricción: • Reacción, mezclar y sedimentarbien. • DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales • 1µg/µl de volumen (no mas) • Amortiguador: iones, sales, pH, distintosparacadaenzima • 10X  1X: dilución 1:10 con el volumen • Enzima: de acuerdo al palíndromeo paraaveriguarsiestapresente • 1U/µg de DNA • Agua paracompletarvolumen • Incubadora a 37oC por 30-60 minutos

  12. Enzimas de restricción: • Factoresqueafectan la reacción: • Composición del amortiguador • Fuerzaiónica: [sales] y Na o K, pH (8) • Temperatura de incubación • 37C, termofílicas a 50-65oC • Termolábiles, 25oC • Metilación • Cepa de E coli, asegurarse de suactividad de metilasas

  13. Enzimas de restricción: • Aplicaciones • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector • Cortar vector y cortarinserto • Mapas de restricción • Determinarlugares de restriccionparaenzimas en algun vector o en unasecuencia a clonar • Southern Blot • Detectar la presencia de un gen o unasecuencia dada en unamezcla de fragmentos de DNA cromosomal

  14. Enzimas de restricción: • Aplicaciones • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector • - cortar el vector • - cortar DNA fuente del inserto de interés • - mezclar y ligar • - transformar • - cultivar en medio de selección por el antibiótico

  15. Enzimas de restricción: • Aplicaciones • Mapas de restricción • - aislar el vector • - incubar muestras de este con la enzima de interés o con combinaciones de estas • - analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños) • - comparar estos con un marcador y determinar sus tamaños • - deducir (lógica) el mapa del vector • Tutorial

  16. Enzimas de restricción: • Aplicaciones • Southern Blot • Aislar genoma • Cortar con enzimas • Electroforesis • Transferencia • Incubar con sonda radioactiva • Autoradiografía • Cuantas copias hay en un genoma? • Hay deleciones? • Se parecen estos genes • Zoo blot (parecido entre especies)

  17. Enzimas de restricción: • Aplicaciones • Southern Blot • Edward Southern -1975cuantas copias de un gen hay en un genoma? • detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico) • identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común. • identificar genes homólogos en distintas especies • el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad

  18. Enzimas de restricción: • Materiales • Microtubos • Micropipetas y puntas • Incubadora • Agua ultrapura • DNA a cortar (x ugs) • Buffer de la enzima de restricción • Enzima de restricción • Hielo

  19. Enzimas de restricción: • Protocolo • 1. Analizar la reacción a realizar • 2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos • 3. Rotular 2 microtubos de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 2P, etc, según aplique. • 4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción • 5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo • 6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden: • Agua • Buffer • DNA • Enzima

  20. Enzimas de restricción: • Protocolo • 7. Mezclar con finger-vortex • 8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg • 9. Incubar por 1 hora a 37oC • 10. Guardar a -20oC • 11. Analizar por electroforesis de agarosa. • Ejemplo de Reacción

  21. Preguntas • Como es mas específicoparaclonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencioneventajas o desventajas de cada forma. • Si unaenzimaviene a 22000 U/ml, cuantos µl necesitoparadigerir 4 µg de DNA? • Porquelasbacterias no digierensupropio DNA con susenzimas de restricción? • Derive una formula paracalcularcuantosfragmentos de DNA salen de unamolécula de DNA cortada con unaenzima de restricción, si la moléculaes lineal vssies circular?

  22. Referencias • Brooker, Robert J. (2014). GeneticsAnalysis & Principles. (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc. • Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York. • http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.html • http://www.restrictionmapper.org/ • http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/renzymes.html

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