1 / 71

Antygeny otrzymane T. gondii w Katedrze Mikrobiologii

Antygeny otrzymane T. gondii w Katedrze Mikrobiologii. Diagnostyka toksoplazmozy. METODY. BEZPOŚREDNIE (mają na celu izolację pasożyta lub wykrycie jego antygenu). POŚREDNIE (wykorzystują właściwości immunogenne pasożyta). Metody diagnostyczne powinny:

elvin
Download Presentation

Antygeny otrzymane T. gondii w Katedrze Mikrobiologii

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Antygeny otrzymane T. gondiiw Katedrze Mikrobiologii

  2. Diagnostyka toksoplazmozy METODY BEZPOŚREDNIE (mają na celu izolację pasożyta lub wykrycie jego antygenu) POŚREDNIE (wykorzystują właściwości immunogenne pasożyta) • Metody diagnostyczne powinny: • potwierdzić lub wykluczyć zarażenie T. gondii; • określić fazę zarażenia (toksoplazmoza wczesna, przewlekła); • u kobiet w ciąży z pierwotną toksoplazmozą potwierdzić lub wykluczyć zarażenie płodu lub noworodka

  3. Testy serologiczne stosowane w diagnostyce toksoplazmozy • Test barwny(antygen żywy / IgG) • Immunofluorescencja pośrednia(antygen utrwalony formaliną / IgG, IgM) • Aglutynacja bezpośrednia(antygen utrwalony formaliną / IgG + IgM) • Test ISAGA(antygen utrwalony formaliną / IgM, IgA, IgE) • Odczyn wiązania dopełniacza(antygen cytoplazmatyczny / IgG + IgM) • Test hemaglutynacji(antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG + IgM) • Test ELIFA (antygen cytoplazmatyczny / IgG, IgM, IgA, IgE) • Awidność przeciwciał (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) • Test ELISA: • pośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgG) • bezpośredni (antygen cytoplazmatyczny + błonowy / IgM i IgA)

  4. Schemat reakcji PCR (amplifikacja DNA genu bag1) PCR 1 PCR 2 PCR 3 ekson 1 ekson 4 ekson 2 ekson 3 ex3 ex4 ex1ex2 PCR 4 232 pz 243 pz 279 pz ex3ex4 437 pz

  5. Konstrukcja plazmidu rekombinantowego EcoRI Produkt PCR 1 pUC19 2686 pz MCS ex1ex2 EcoRI SmaI EcoRI / SmaI pUC19/ex1ex2 2943 pz HindIII ex3ex4 SmaI / HindIII pUC19/BAG1 CCT CCC CCC GGG Pro ProPro SmaI 3080 pz Produkt PCR 4

  6. Konstrukcja plazmidu rekombinantowego pUET1 2856 pz MCS BglII HindIII bag1(694 pz) pUET1/BAG1 pUC19/BAG1 3465 pz 3080 pz BglII / HindIII Klonowanie do wektora ekspresyjnego pUET1 w miejsca restrykcyjne BglII i HindIII DNA produktu PCR

  7. (B) (A) (C) M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 5 6 Immunoidentyfikacja i oczyszczanie rekombinantowego białka BAG1 Rys. (A) Wyniktestu Western blotting z użyciem przeciwciał skierowanych na domenę S-Tag; (B) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach zebranych lizatów w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE); (C) Rozdział elektroforetyczny białek zawartych we frakcjach uzyskanych podczas oczyszczania białka rekombinantowego BAG1 w 12% żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE).

  8. Test Western blotting M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – GRA5 3 – GRA9 4 – GRA4 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) IgM +, IgG + / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła ??? M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła IgM -, IgG 48 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła

  9. Test Western blotting M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M – marker wielkości 1 – MIC3 2 – MAG1 3 – SAG4 4 – p35 IgM +, IgG + / niska awidność Toksoplazmoza wczesna (ostra) IgM -, IgG >300 IU/ml / wysoka awidność Toksoplazmoza przewlekła

  10. Test Western blotting 1 PACJENT M 1 2 3 M 1 2 3 M – marker wielkości 1 – MAG1 2 – p35 3 – SAG4 1 pobranie surowicy TOKSOPLAZMOZA WCZESNA 2 pobranie surowicy (8 miesięcy później) TOKSOPLAZMOZA PÓŹNA

  11. DNA szczepionki

  12. DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek • Ściśle zdefiniowany skład • zawierają geny kodujące określone antygeny białkowe lub sekwencje kodujące determinanty antygenowe • Bezpieczeństwo • brak możliwości wywołania infekcji • możliwość wywołania choroby autoimmunologicznej • indukcja produkcji autoprzeciwciał skierowanych przeciwko komórkom, w których następuje biosynteza obcego antygenu • możliwość integracji DNA plazmidowego z ludzkim DNA • Skuteczność • wywołują zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź immunologiczną • uzależniona od rodzaju kodowanego antygenu • uzależniona od poziomu ekspresji antygenu w komórce docelowej

  13. DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek • możliwość stosowania tylko jednej dawki szczepionki • długotrwała prezentacja antygenu systemowi immunologicznemu – biosynteza antygenu in vivo • możliwość stosowania jako szczepionki profilaktyczne lub terapeutyczne • ochrona przed infekcją • stymulacja układu immunologicznego u osobników zainfekowanych • możliwość stosowania u niemowląt posiadających jeszcze matczyne przeciwciała • DNA plazmidowe nie jest rozpoznawane i neutralizowane przez przeciwciała • długotrwała prezentacja antygenu umożliwia rozwój prawidłowej odpowiedzi immunologicznej • możliwość wywoływania odporności na różne szczepy tego samego wirusa lub bakterii • możliwość wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko bardziej zakonserwowanym antygenom niż antygeny powierzchniowe

  14. DNA szczepionki Charakterystyka szczepionek • Możliwość stosowania jako szczepionki skojarzone lub poliwalentne • kilka plazmidów kodujących różne antygeny • jeden plazmid kodujący kilka antygenów • Możliwość dostarczania DNA do organizmu różnymi sposobami • Łatwa formulacja szczepionek • brak konieczności stosowania adiuwantów, substancji konserwujących i stabilizujących • Stabilność termiczna • liofilizowane lub sprecypitowane DNA można bardzo długo przechowywać w temperaturze pokojowej • Niski koszt produkcji • możliwość produkcji dużych ilości plazmidowego DNA w komórkach bakteryjnych • łatwa i tania procedura oczyszczania plazmidowego DNA - liza alkaliczna

  15. DNA szczepionki Sposoby formulacji i podawania szczepionek DNA • domięśniowo (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) • wydajność dostarczania DNA wzrasta, jeżeli jest podawane do regenerujących się mięśni • śródskórnie (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej) • dożylnie (iniekcja, DNA wewnątrz liposomów) • przez błony śluzowe • donosowo; DNA w roztworze soli fizjologicznej, w postaci aerozolu • doustnie; mikrokapsułki z biodegradowalnych polimerów zawierające DNA • przez skórę • skaryfikacja; DNA w roztworze soli fizjologicznej • dostarczanie za pomocą pistoletu genowego, cząsteczki złota opłaszczone DNA (DNA dostarczane bezpośrednio do wnętrza komórek)

  16. DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) • bakteryjne ori replikacji • zapewnia dużą liczbę kopii plazmidowego DNA w komórce bakteryjnej • prokariotyczny marker selekcyjny • umożliwia łatwą identyfikację komórek bakteryjnych transformowanych DNA plazmidowym • miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) • umożliwia łatwe wprowadzenie genu kodującego antygen w obręb DNA plazmidowego

  17. DNA szczepionki Wektory plazmidowe stosowane do produkcji DNA szczepionek (wektory wahadłowe) • elementy regulujące transkrypcję w organizmach eukariotycznych • silne promotory pochodzenia eukariotycznego lub wirusowego • promotor CMV ludzkiego wirusa cytomegalii • promotor SV40 małpiego wirusa S40 • promotor CKM mięśniowo-specyficznej kinazy kreatyny • eukariotyczne lub wirusowe terminatory transkrypcji zapewniające poliadenylację mRNA • sygnał poliadenylacji wirusa S40 • sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH)

  18. Odpowiedź immunologiczna indukowana przez szczepionki DNA

  19. DNA szczepionki Możliwości zwiększenia skuteczności szczepionek DNA • zwiększenie poziomu ekspresji genu kodującego antygen • nowe silne promotory • promotory tkankowo-specyficzne • sekwencja Kozaka inicjacji translacji w komórkach eukariotycznych (-6GCCAGCCAUGGG+4) • codon usage – stosowanie kodonów preferowanych przez komórki ssacze • multimeryzacja genu kodującego antygen • zwiększenie immunogenności DNA szczepionki • wprowadzenie do wektora plazmidowego immunogennych sekwencji CpG • koekspresja antygenu z cząsteczkami immunostymulującymi

  20. Szczepionki DNA poddawane próbom klinicznym

  21. Metody genotypowe najczęściej stosowane w badaniach epidemiologicznych • Makrorestrykcyjna analiza genomowego DNA połączona z elektroforezą pulsacyjną (REA/PFGE) • Multilocus Sequence Typing (MLST) • Mikromacierze DNA • Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego DNA (PCR/RFLP) • Repetytywny ekstrageniczny palindromowy PCR (Rep-PCR) • Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA (RAPD) • Rybotypowanie • Metody oparte o ligację adaptorów Z wymienionych największą moc dyskryminacyjną mają techniki polegające na analizie całego materiału genetycznego komórki

  22. „Złoty standard” w typowaniu mikroorganizmów” Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową(RFLP-PFGE) Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego DNA genomowego trawieniu enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis). Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie pulsowej jest obecnie metodą standardową w epidemiologii szpitalnej.

  23. Krawczyk, B., Lewandowski, K., Bronk, M., Samet, A., Myjak, P., Kur, J.: Evaluation of a novel method based on amplification of DNA fragments surrounding rare restriction sites (ADSRRS fingerprinting) for typing strains of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. J. Microbiol. Meth. 52 (2003) 341-351. Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury i zachowania stałych warunków analizy.

  24. Cechy efektywnej metody typowania szczepów: •Wysoki stopień dyskryminacji • Powtarzalność • Zdolność do typowania wszystkich szczepów • Prosta w użyciu • Szybkość • Mało kosztowna • Wystandaryzowana Potrzeba poszukiwania nowych metod typowania genetycznego, które powinny charakteryzować się prostotą wykonania, porównywalną siłą dyskryminacji do RFLP/PFGE, niskimi kosztami oraz łatwością adaptacji do badań rutynowych

  25. METODY FINGERPRINTING Wiele obecnie stosowanych technik typowania molekularnego opiera się na analizie całego genomowego DNA Metody te wykorzystują: • analizę restrykcyjną • amplifikację fragmentów DNA in vitro, przy zastosowaniu reakcji PCR Rozdział powstałych fragmentów DNA o różnej długości uzyskuje się przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymany w ten sposób profil prążków jest charakterystyczny zarówno dla wybranej metody jak i dla badanej próby. Różnice we wzorach świadczą o odmienności genetycznej badanych organizmów.

  26. wzór elektroforetyczny = „odcisk palca”

  27. Metody typowania molekularnego oparte na technice ang. Ligation Mediated PCR AFLP- Amplified Fragment LengthPolymorphism, IRS- PCR – Infrequent Restriction Site PCR, ADSRRS- fingerprinting – Amplification ofDNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites PCR- MP – PCR Melting Profiles.

  28. LM PCR (ang. Ligation – Mediated Polimerase Chain Reaction) Technika ta umożliwia analizę całego genomowego DNA zarówno prokariotycznego jak i eukariotycznego, bez potrzeby znajomości jego sekwencji Etapy: • trawienie restrykcyjne • ligacja adaptorów • reakcja pre –PCR • reakcja PCR • elektroforeza produktów amplifikacji

  29. 5’ - - 5’ 5’ - 5’ - - 5’ - 5’ P P P P P P Trawienie restrykcyjne G GATC C G GATCC G GATCC G GATCC G G CCTAG C CTAG G CCTAG CCTAG G

  30. GATC CTAG P P Ligacja adaptorów oligonukleotydowych CTAG 5’ - CTAG - 5’ 5’ - - 5’

  31. CTAG GATC CTAG CTAG P P Ligacja adaptorów oligonukleotydowych 5’ - 5’ - - 5’ - 5’

  32. CTAG GATC CTAG CTAG P P Ligacja adaptorów oligonukleotydowych

  33. GATC CTAG Ligacja adaptorów oligonukleotydowych CTAG CTAG

  34. CTAG CTAG Reakcja pre - PCR GATC CTAG

  35. GATC CTAG Reakcja PCR

  36. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym 1 2 3

  37. Td [ºC] 100 75

  38. Td [ºC] 100 75

  39. PCR MP – PCR Melting Profile Ograniczoną reprezentację genomu można otrzymać stosując LM PCR z niższą niż zwykle temperaturą denaturacji w trakcie reakcji PCR

  40. PCR MP- cechy Zalety: • Metoda nie wymaga znajomości analizowanej sekwencji; • Prosta analiza wyników rozdziału w żelu poliakryloamidowym wybarwionych bromkiem etydyny; • Ten sam adaptor i enzym restrykcyjny może być użyty do analizy DNA różnych gatunków organizmów; • Wysoki potencjał różnicujący; • Metoda szybka i stosunkowo tania ; • Bardzo dobra powtarzalność uzyskiwanych wyników; Wady: • Termocykler gradientowy; • Kalibracja termocyklera;

  41. PCR MP - PCR Melting ProfileEtap wstępny Gradient temperatury denaturacji Wybór odpowiedniej temperatury denaturacji 87,7oC

  42. PCR MP w wykrywaniu zakażeń szpitalnych na poszczególnych oddziałach szpitala Krawczyk, B., Samet, A., Leibner, J., Śledzińska, A., Kur, J.: Evaluation of a PCR melting profile (PCR MP) technique for bacterial strain differentiation. J. Clin. Microbiol. 44 (2006) 2327-2332. H2

  43. PCR MP w badaniu indywidualnego pacjentaSytuacja epidemiologiczna indywidualnego pacjenta

  44. PCR MP w badaniu indywidualnego pacjentaBadanie transmisji (translokacji) bakterii Co to jest translokacja bakterii? migracja bakterii pochodzących z prawidłowej flory bakteryjnej i ich toksyn przez ścianę przewodu pokarmowego i układu moczowego, co w konsekwencji może wywoływać bakteriemię, zakażenia narządowe, a nawet posocznicę oraz zapalenie otrzewnej u chorych z marskością wątroby.

  45. PCR MP w badaniu indywidualnego pacjentaBadanie transmisji (translokacji) bakterii Nr translokacji Nr izolatu Data izolacji Nr pacjenta Źródło izolacji Genotyp 1 12 07.02.05 6 krew H13 13 07.02.05 kał H13 2 69 10.05.05 6 krew H20 70 10.05.05 kał H20 3 39 15.02.05 24 krew H15 40 18.02.05 kał H15 4 1 12.11.04 1 krew T1 2 12.11.04 mocz T1 5 35 12.02.05 23 krew T2 36 13.02.05 mocz T2 37 15.02.05 kał T2 6 23 14.12.04 15 krew P1 24 15.12.04 kał P1 7 45 22.02.05 26 krew H17 46 25.02.05 kał H17 8 28 01.01.05 17 krew H9 29 02.01.05 mocz H9 9 52 03.03.05 31 krew T4 53 04.03.05 mocz T4 10 33 12.02.05 22 krew IM1 34 13.02.05 kał IM1 11 67 03.05.05 40 krew UG1 68 03.05.05 mocz UG1

  46. PCR MP w badaniu indywidualnego pacjentaBadanie transmisji (translokacji) bakterii Gradient temperatury denaturacji Potwierdzenie pokrewieństwa genetycznego

  47. Optymalizacja procedury PCR MP dla Enterococcus faecium Optymalizacja - cykl badań, który pozwoli określić parametry krytyczne poszczególnych etapów metody oraz wyznaczyć ich wartości optymalne • Cel optymalizacji: • skrócenie czasu przeprowadzania badania • zmniejszenie stopnia skomplikowania przeprowadzania badania • obniżenie kosztów analizy • z zachowaniem jakości i powtarzalności otrzymywanych wyników

  48. Trawienie restrykcyjne genomowego DNA Reakcja ligacji Inaktywacjatermiczna Reakcja PCR Elektroforeza poliakrylamidowa Wizualizacja Izolacja genomowego DNA Enterococcus faecium • Podczas optymalizacji PCR MP badano wpływ zmiany: • ilości, rodzaju i stężenia stosowanych odczynników • czasu trwania poszczególnych etapów • temperatury poszczególnych etapów na jakość otrzymywanych wyników • W wyniku optymalizacji PCR MP określono: • parametry krytyczne metody • wartości optymalne badanych parametrów

  49. M 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5 2 3 4 5 6 10 M 0.1 0.5 1 2 3 4 5 10 K- Wyznaczenie parametrów krytycznych Wyznaczenie ilości mieszaniny ligacyjnej w reakcji PCR Wyznaczenie aktywności enzymu restrykcyjnego Rys.1. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości enzymu restrykcyjnego w reakcji trawienia; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.1 – 10 –ilości enzymu w kolejnych próbach Rys.2. Obraz elektroforetyczny produktów PCR, przy zastosowaniu różnej ilości mieszaniny ligacyjnej; M – marker wielkości DNA (100 – 1000), K- kontrola ujemna, 0.2 – 10 – objętość mieszaniny ligacyjnej w kolejnych próbach [ul]

More Related