Sünnieelse diagnostika uued võimalused

1. Sünnieelse diagnostika uued võimalused Loote testid rakuvabast DNAst ema veres Tiina Kahre 6. Detsember 2013

2. Sissejuhatuseks • Raseduse ajal on ema ja loote vereringed eraldatud platsenta membraanidega. Vaatamata sellele aga toimub kahesuunaline rakkude liikumine ema ja loote vahel. • Selgeid tõendusi loote rakkude liikumisele läbi platsenta barjääri saadi juba üle 30 aasta tagasi • näidati, et loote lümfotsüüdid tsirkuleerivad rasedate naiste veres (Herzenberg et al., 1979; Iversonet al., 1981).

3. Loote rakuvaba DNA ema veres • 1997- meessoost loote rakuvaba DNA (cell free fetal DNA e. cffDNA) avastamine ema veres (Lo et al, Lancet 1997) • 1994-2002 NIFTY multi-keskus uuring (NationalInstituteofChildHealth and HumanDevelopmentFetalCellIsolationStudy) (Bianchi, 2002) • 3000 raseda vereproovid • On vaja tehnoloogilisi uuendusi, et viia loote rakkude testimine ema veres kliinilisse praktikasse • 2007 - 2008 – cffDNA diagnostika rakendamine loote aneuploidiate sõeltestimisel Fan et al, AnalChem 2007; Lo et al, PNAS, 2007 Fan PNAS 2008 Chiu PNAS 2008

4. Loote rakuvaba DNA (cffDNA) ema veres • Ema vereringes esineb erinevat tüüpi loote rakke: trofoblaste, erütroblaste, leukotsüüte • RakuvabaDNA pärineb põhiliselt apoptootilistest rakkudest, ringleb vereplasmas väikeste fragmentidena (150-200 aluspaari) • cffDNA pärineb põhiliselt tsütotrofoblasti rakkudest (platsentast), vabaneb suuremal hulgal I trimestril • cffDNAdetekteeritav alates 5.-6. rn, • Degradeeritakse minutite kuni 2 tunni jooksul peale sünnitust Alberry et al 2007; Ghorbian, 2012

5. Rakuvaba DNA ema veres • Rakuvaba DNA (cell free DNA - cfDNA) ema veres pärineb nii emalt kui lootelt • Kui eraldatakse DNAd, saame DNA lahuse, milles on nii ema kui ka loote DNA • Oluline on ema DNA ja loote DNA suhe • Diagnostika võimalused • Testida järjestusi, mida emal pole nt. • Y kromosoomi järjestused soo määramiseks • RhD geeni järjestus reesusnegatiivsel emal Kasutusel hetkel Geneetikakeskuses (Altmäe jt, Eesti Arst 2005)

6. cffDNA hulk ema veres 10.-20. rasedusnädalalema veres ringlevast cfDNAst on loote päritolu keskmiselt 11-13,4% loote päritolu Wang et al. Prenat Diagn 2013 22384 rasedat 10-40.rn • 10.-21. rn. suurenes loote DNA hulk 0.1% nädalas •Alates 22. rn suurenes loote DNA osakaal 1% nädalas • Kaasaegsed meetodid vajavad vähemalt 4% looteDNA osakaalu ema rakuvabast DNAst • 2% uuritavatest cffDNA alla 4% Wang et al, Prenat diagn 2013

7. cffDNA hulk ema veres • Kasutamine prenataalseks diagnostikaks optimaalne alates 10.-12 rasedusnädalast Nicolaides et al,PrenatDiagn2011;Ashoor et al ,Ultrasound Obstet Gynecol 2013; Wang et al. Prenat Diagn 2013

8. cffDNA osakaalu vähendavad faktorid • Ema ülekaalulisus • Rasedus alla 10.rn. • Vere kogumise metoodika • Oluline kohene plasma fuugimine • Mitmeetapiline protokoll • Vajadus spetsiaalse tuubi • Cell-free DNA BCT tuubid (Streck, Inc. Versus • K3EDTA tuubid (lilla kork) Wang et al. Prenat Diagn 2013 Fernando et al Prenat Diagn 2010 Ashoor et al, Am J Obstet Gynecol 2012

9. cffDNA osakaalu suurendavad faktorid • Preeklampsia Lo et al, Clin Chem 1999; Zhong et al, Am J Obstet Gynecol 2001 • Enneaegsus Leung et al, Lancet 1998; Zhong et al, Mol Hum Reprod 2002 • Hyperemesis gravidarum Sekizawa et al, Clin Chem 2001 • Polühüdramnion Zhong et al, Prenat Diagn 2000 • Platsenta puudulikkus ja irdumine Zhong et al, Prenat Diagn 2006 • PAPP-A ja β-hCG MoM ↑ • Suitsetajad  vs. mittesuitsetajad? • Kaukaaslased  vs afro– ameeriklased? • Lootel trisoomia21 ? Ashoor et al, Ultrasound Obstet Gynecol2013, Norton et al, 2012

10. cffDNA osakaalu ei mõjuta • Ema vanus • Ema pikkus • Viljastumise viis (nt. IVF) • Kuklavoldi suurus • Loote sugu • Kromosomaalsed ümberkorraldused lootel Ashoor et al, Ultrasound Obstet Gynecol2013, Norton et al,Am J ObstetGynecol 2012

11. Hetkel rakendatavad MIPD tehnoloogiad • PCR Reaalaja PCR (RhD geeni diagnostika, soo määramine) ________________________________________ • Uue põlvkonna sekveneerimise/SNP põhised metoodikad • Massively parallel signature sequencing (MPSS) • Kogu genoomi analüüs Nt. võrdleb 21.kromosoomi järjestuste lugemite hulka normaalsete kromosoomidega ja normaalsete patsientide 21kromosoomi lugemitega (21kr. 1,5% kõigist lugemitest) • DANSR (Digital Analysis of Selected Regions) technology targetedsequencing • Ainult mõnede kromosoomide analüüs, andmemaht , hind  • Next generation SNP-based targeted aneuploidy testing • U. 20.000 SNP-d MIPD-mitteinvasiivne sünnieelne diagnostika

12. Kasutusel olevad kommertsiaalsed testid MIPD diagnostikaks *Lifecodexx- Saksamaal, Euroopas, Sequenomi partner, alates okt 2013 pakub kiirtesti Agarwal et al, Prenat Diagn 2013

13. MIPD meetodite efektiivsus • Sensitiivsus • Trisoomia 21 suhtes 99% • Trisoomia 18 suhtes 97-99% • Trisoomia 13 suhtes 87-90-99% • 45, X suhtes 95% • Vale-positiivsus ~0,1-0,5% • erinevate kromosoomide suhtes erinev T21 0,03%, T180,07% • Vale-positiivne tulemus võib samas näidata muid lootega mitteseotud olulisi patoloogiaid • Vale-negatiivsus väga madal (0,001%) • Samas T18 kõrgem 3,6% (38 indiviidi) Walsh et al, Prenat Diagn 2013, Nicolaides et al, PrenatDiagn2013, Norton, AJOG 2012

14. MIPD võrdlus Positiivne Negatiivne • Mitteinvasiivne • Parem tundlikkus T21, T18,T13, (X,Y) vs. I trimskr • Saab infot ainult T21,T18, T13 (X,Y kromosoomide) suhtes • Varajane, 10-12.rasedusnädal • Pole limiteeritud ras.näd. ülemine piir • Viib invasiivsete protseduuride vähenemiseni • testi eelne ja järgne konsultatsioon lihtsam kui kombineeritud skr. puhul • Jääb avastamata 20-30% kromosomaalsetest muutustest • Hetkel pole valideeritud üldpopulatsiooni skriininguks • Kõrge riski grupis sõltub esmasest seerumskriiningu +NT tulemustest • Kallis, pole kulu tõhusat analüüsi • UH enne analüüsi ja peale • 2% rasedatest cffDNA suhe  • Pole võimalik testida • mitmikrasedusi • Mosaiiksust • Eristada kromos. anomaaliat emal või lootel Nicolaides, 2013, Walsh , 2013, Bianchi, 2013, Norton 2012

15. Tänan tähelepanu eest!