I) Obtention de l’ADN recombinant

1. I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplicationautonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADNd'intérêt Le clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un vecteur, ce qui permet ensuite d'exprimer l'ADN dans des cellules 3) Présentation d’un vecteur

2. 3) Présentation d’un vecteur de clonage Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B) Cosmides Bactériophages Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC) Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi) • Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été largement modifiés

3. 3) Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur • Capacité de réplicationautonomedansune cellule hôtedonnée • Possession d’un site de clonage multiple pour l'insertion du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4)) • Insertion d'un fragment d'ADN plus oumoins grand biensupportée • Présencefréquente d’un marqueur de sélection(gène de résistance à un antibiotique, marqueur de sélectionmétabolique)

4. 3) Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide Promoteur (pour pouvoirexprimer la protéined'intérêtilfaut cloner la séquenced'ADN en phase avec le promoteur (cf. cadre de lecture de la traduction) a) Vecteur Site de clonage multiple : nombreux sites de restriction (voir 4)) uniquespermettantl'insertion de l'ADN après le promoteur Plasmide : petite moléculeextrachromosomique, d'ADN double brincirculaire, de 3 à 10 kilobases. Capable de se répliquerindépendamment du chromosome bactérien et pouvantêtretransféréd'une cellule à uneautre. Origine de réplicationdans la bactérie Marqueur de sélection : résistance contrel'antibiotiquekanamycine

5. I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplicationautonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADNd'intérêt Insertion du fragment d'intérêtdans levecteur 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur :

6. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Définition des enzymes de restriction Uneenzyme de restrictionestuneprotéine capable de couper un fragment d'ADN au niveaud'uneséquence de nucléotidescaractéristiqueappeléesite de restriction. C'estuneendonucléase(coupure à l'intérieur du brind'ADN au niveau des liaisons phosphoesters). Plusieurscentainesd'enzymes de restriction sontactuellementconnues, dont un grand nombre se retrouvenaturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuventcouper (et ainsiconduire à la destruction) de l'ADNétranger (notamment des virus). Celalimite les infections virales chez les bactéries, d'où le terme de restriction. L'ADN bactérienlui-mêmeest protégé de la coupure par des modifications du type méthylation.

7. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Exemple d’une enzyme de restriction Coupure par EcoRI 3' 5' 5' G AATTC CTTAA G 5' 5' 3' Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants Exemple : site de restriction de l'enzymeEcoRI (provenant de la bactérieEscherichia coli) Rq : Certaines enzymes donnent des bouts francs après coupure. Exemple : SmaI : CCC GGG GGG CCC GAATTC CTTAAG 5' 3' 3' 5' Rq : Certains sites de restriction sont des séquences palindromiques 7

8. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Principe Digestion 1 heure dans le tampon adapté à l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température optimale de l'enzyme Vecteur (plasmide) Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Si l’on digère le fragment d’ADN par les deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des bouts collants, on obtient des extrémités cohésives complémentaires avec celles du vecteur. Ceci permet l’insertion du fragment d’ADN dans le vecteur. Vecteurdigéré + AATT Fragment à cloner TTAA Vecteur Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide AATT TTAA

9. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :Digestion du fragment d’ADN Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de l’ADN à cloner ? Cela se fait par PCR avec des amorces spéciales : 5'TATCG TC G G A ATC CAT G C GT ACG 3' 3' C G C G T C3' 3'ATA GCA G C CT TAG G TAC G CAT G C 5' 5' 5' ADN d'intérêt Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 2 Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 1

10. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :Digestion du fragment d’ADN Voicil'ADNobtenu après PCR, avec les sites de restriction à sesextrémités. Il pourraêtreutilisé pour le clonage. 5' 3' G TC G G A ATC CAT G C G CA G C CT TA G G TAC G C 5' 3' ADN d'intérêt Séquence du site de restriction de l'enzyme 1 Séquence du site de restriction de l'enzyme 2

11. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :Digestion du vecteur Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Vecteur (plasmide) Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Le fragment d’ADN doit être cloné dans le vecteur digéré. Le petit fragment dégagé peut se réinsérer dans le vecteur digéré à la place du fragment d’ADN à cloner. Il est donc nécessaire de séparer les deux produits de la digestion du vecteur et de purifier le vecteur digéré pour la suite du clonage. Vecteurdigéré + Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide

12. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré L’électrophorèse est une méthode de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique. Elle s’applique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques, nucléotides La migration dépend de la charge et de la géométrie des particules L’électrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un support homogène, poreux et relativement inerte (papier, gels…)

13. Principe : migration des fragments d'ADNdans un champ électrique, séparation en fontion de leurtaille 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Les fragments de restriction sont visualisés sur gel d'agarose par électrophorèse : ci-contre le dispositif utilisé Dépôt des échantillons dans les puits du gel Gel d'agarose - champ électrique Solution d'électrolyte qui recouvre le gel (assure la conduction électrique) Générateurélectrique +

14. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Principe de l’électrophorèse : Fragments de restriction : vecteur digéré et bout dégagé par la restriction Dépôt dans le puits du gel - Les fragments d'ADNmigrent de façoninversementproportionnelle à leurtaille : les plus gros fragments migrentpeutandis que les petits fragments migrent beaucoup Migration des fragments d'ADN entre les particules de gel selon le gradient électrique (les acides nucléiques sont globalement négatifs, déplacement vers le pôle +) + Particule de gel

15. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Marqueur de poidsmoléculaire : fragments de tailleconnue (obtenus par exemple après digestion enzymatique de l'ADN du bactériophage Lambda) => celapermet de déterminer la taille des bandesd'intérêt par comparaison au marqueur Révélation du gel par incubation avec un intercalant d'ADN (fluorescent) 1 2 1 : bande du vecteur digéré 2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne, lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage. Cette purification sur gel permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré. Si le fragment d’ADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur colonne peut être suffisante.

16. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur Fragment d‘ADN à cloner Vecteur (plasmide) 3' 5' 3' 5' Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Digestion du vecteur et du fragment d’ADN à cloner par les enzymes 1 et 2 3' 5' Vecteurdigéré 5' 3' => Création d'extrémités collantes complémentaires. Insertion du fragment d’ADN dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au niveau des extrêmités complémentaires. Il reste à lier ces deux morceaux d’ADN de façon covalente. + Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide

17. 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur OH 3' • La ligaseestune enzyme capable de former des liaisons covalentes(formation de liaisons phosphoester) entre deuxmoléculesd'ADN(au niveaud'une zone d'hybridation des moléculesd'ADN) P 5' 5' P Ligase 3' 0H -0-P- • Intérêt d'utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion : • insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur • limitation de la religation du vecteur sur lui-même -P-0- Fragment d'ADNd’intérêtinsérédans le vecteur Après ligation, on obtient un plasmiderecombiné Liaison phosphoester