Einleitung

1. pODC Konstrukte (hergestellt durch PCR) -596 bp -264 bp -49 bp +306 bp Ctrl HPL 0 10 20 30 40 50 60 70 25 § Ctrl ** § ** + PGE2 20 + cAMP 15 10 5 0 Ctrl HPL Ctrl DFU NS-398 anti-PGE2 Ak Ctrl + PGE2 + cAMP 12000 40 3500 ** ** §§ ** ** Ctrl 35 10000 §§ 3000 ** 30 + PGE2 8000 2500 25 + cAMP § 6000 20 § § § 2000 § § § 15 4000 ** § 1500 10 § 2000 1000 5 0 0 500 Ctrl HP HPL Urease Ctrl HP HPL Urease 0 Ctrl HPL Aktivierung der Ornithindecarboxylase (ODC) durch Cyclooxygenase (COX)-2 in H.-pylori(Hp)-stimulierten Makrophagen (MØ): Ein Mechanismus für die Dysregulationder angeborenen Immunantwort A. Scholz1,3, F.I. Bussiere1,4, M. Asim 1,4, R. Chaturvedi1,4, Y. Cheng1,4, H.X. Xu1,4, M. Schneemilch1,3, F. Meyer3, K.T. Wilson1,2,4. 1Division of Gastroenterology, Department of Medicine, 2Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine; 3Otto von Guericke University, Magdeburg, Germany; 4Veterans Affairs Maryland Health Care System, Baltimore, MD. P O S T E R of DISTINCTION – “Digestive Disease Week, May 15-18, 2005 (Chicago, U.S.A.) & Ziele Hypothesen Design & Methoden Einleitung • Folgende Aspekte sind im Zusammenhang mit der Immun-antwort auf H.-pylori-Infektion bekannt: • Die Ornithindecarboxylase ist hochreguliert in M [Gobert et al. J Immunol 168:4692-4700, 2002; Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161-40173, 2004], die daraufhin Polyamine (Spermin u.a.) produzieren. • Spermin dysreguliert die dem Wirt angeborene Immunantwort durch: • Hemmung der antimikrobiellen NO-Produktion[Bussiere et al. J Biol Chem 280:2409-2412, 2005]. • Induktion von Apoptose [Gobert et al. J. Immunol. 168:4692-4700, 2002; Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161-40173, 2004]. • Aktivierung von COX-2 reguliert die Th1-Immunantwort durch die Generation von PGE2 & dem „Second messenger”, zyklisches AMP (cAMP) [Meyer et al. J Immunol 171:3913-3917, 2003]. • PGE2 oder cAMP hemmen die IFN-γ- & IL-12-Freisetzung & Lymphozytenproliferation als Antwort auf H. pylori. • Hemmung von COX-2 hat den gegenteiligen Effekt. • cAMP agiert über Aktivierung des ODC-Promoters. RAW 264.7 M- Zelllinie (106/ml) Zu bestimmen, ob: • ODC auf dem Level der Promoteraktivierung, der Transkription, reguliert wird; • COX-2 exprimiert & PGE2 sowie „2nd messenger“ cAMP vor dem Höhepunkt der ODC-Induktion produziert werden; • PGE2 &/oder cAMP direkt ODC aktivieren oder sie die Hp-stimulierte ODC- Aktivierung erhöhen können; • die ODC-Aktivierung COX-2 erfordert. • Werden M mit H. pylori stimuliert, ist über die Aktivierung des ODC-Promoters ODC stark induzierbar. • Vergleichbar mit dem Effekt auf Zytokine kann die COX-2-Induktion & resultierendes PGE2 die ODC-Expression &-Aktivität alterieren. • cAMP, der „down stream 2nd messenger“ & durch PGE2 aktiviert, kann die Induktion von ODC vermitteln. Stimulation mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien oder „French-press“-Lysaten & rekombinanter Urease (0 – 24 h); -/+ PGE2, cAMP, DFU, NS-398, anti-PGE2 Ak ODC-Promoter Assays Luciferase-Reporter Zellextrakte Nucleäre Extrakte mRNA Überstände ODC COX-2 RT-PCR/ „Real- time“- PCR ODC-Promoter Bindung EMSA ODC-Aktivität Radiochem. Assay PGE2 ELISA cAMP-Level ELISA ODC-Protein Western Blot Der –264 bp-ODC-Promoter ist für die Transkription erforderlich Parallele Induktion von ODC-Promoter- aktivität, -mRNA-Expression & -Enzym- aktivität Design & Methoden - Transfektionsstudien ODC-Luc -264bp -596 * Luc ODC-Luc -264 * Luc ODC-mRNA-Expression (Anstieg als Vielfaches) M ODC-Promoteraktivität (Anstieg als Vielfaches) ODC-Enzymaktivität (pmol CO2/h/mg Protein) -49 M Luc - HP + HP +306 Luc - HP + HP + PGE2, cAMP + PGE2, cAMP Ctrl Ctrl Zeit (h) Zeit (h) Zeit (h) Zeitverläufe der Aktivierung von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression & ODC- Aktivität als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI: 100) für o.g. Zeit versetzt. A: ODC-Promoter-Assays wurden mittels des –264 bp-Promoterkonstruktes vollzogen. B: Für die ODC-mRNA-Expression wurde die „Real-time“-PCR verwendet. C: Beim ODC-Assay wurde die Summe des von L-[14C]Ornithin freigesetzten 14CO2 gemessen. *p < 0.05 vs. nichtstimulierte Kontrolle RLU x 103/mg Protein Identifizierung der für H. pylori verantwortlichen ODC-Promoterregion. RAW 264.7 Zellen wurden mit einem H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für 6 h inkubiert. ODC-Promoterkonstrukte wurden mittels PCR eines pODC-Musters hergestellt, das von J. Cleveland (St. Jude Children’s Research Hospital) bereitgestellt wurde. *p < 0,05 vs. nichtstimulierte Kontrolle ODC Luciferase Reporter Assay Zeitverläufe der ODC-mRNA- & -Proteinexpression PGE2 & cAMP potenzieren die durch H. pylori stimulierte ODC- Promoteraktivität Zeitverläufe der COX-2-Expression, PGE2-Freisetzung & cAMP-Produktion gleichen der Induktion von ODC h B A Effekt der Zugabe von PGE2 & cAMP auf die Induktion des ODC-Promoters durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysaten (HPL; MOI: 100) für 6 h behandelt, -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 µM) oder zellpermeablem cAMP- Analogon, 8-bromo-cAMP (0.1 µM). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle, §p < 0,05 vs. HPL-stimulierte Zellen -/+ PGE2 oder cAMP. A PGE2 (pg/ml) B Zeitverläufe der COX-2-mRNA- Expression, PGE2-Freisetzung & cAMP-Erzeugung als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H. pylori SS1 für o.g. Zeiten stimuliert. A: RT-PCR- Analyse der COX-2-mRNA-Expression. B: PGE2-Freisetzung im Medium; Daten für Stimulation mit intakten H. pylori (HP) & „French-press“-Lysaten (HPL) jeweils MOI 100. C: Detektion von cAMP in M-Lysaten. For B & C: *p<0,05; **p<0,01 vs. nichtstimulierte Zellen. ODC-Promoteraktivität (RLU x 103/mg Protein) C Zeitverläufe der Aktivierung von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression & ODC-Aktivität als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für o.g. Zeit stimuliert. A: RT-PCR-Analyse der ODC-mRNA-Expression. B: Western-Blot-Analyse der ODC-Proteinexpression. Die Korrelation der Höhepunkte der mRNA- & Proteinexpression bei 6 h mit den Promoter- & Enzymaktivitätsassay-Daten der vorherigen Abbildung sind unbedingt zu beachten. cAMP (pmol/mg Protein) Zeit (h) PGE2 & cAMP potenzieren H.-pylori-stimulierte ODC-mRNA-Expression PGE2 & cAMP potenzieren H.-pylori-stimulierte ODC-Enzymaktivität H.-pylori-stimulierte ODC-Aktivität wird durch COX-2 & PGE2 vermittelt Effekt der Zugabe von PGE2 oder cAMP auf die Induktion der ODC-Enzymaktivität durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori [SS1]-Lysaten (HPL; MOI: 100) für 6 h stimuliert -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 mM) oder zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle, §p < 0,01 vs. HPL-stimulierte Zellen -/+ PGE2 oder cAMP. ODC-mRNA-Expression (Anstieg als Vielfaches) ODC-Activität (pmol CO2/h/mg protein) ODC-Activität (pmol CO2/h/mg Protein) Effekt der Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 auf H.-pylori-stimulierte ODC-Aktivität. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien (HP; MOI: 100), H.-pylori-“French-press“-Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50 µg/ml) stimuliert ohne (Ctrl, gelbe Balken) & mit COX-2-Inhibitoren wie z.B. DFU (10 µM), NS-398 (1 µM) oder neutralisierendem anti-PGE2-Ak 2B5 (135 mg/ml). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle; §p < 0,05 vs. stimulierte Zellen -/+ Inhibitor. Effekt der Zugabe von PGE2 oder cAMP auf die Induktion der ODC-mRNA-Expression („Real-time“-PCR) durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien (HP; MOI: 100), -Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50 g/ml) für 6 h behandelt -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 µM) oder zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). Hier Daten eines repräsentativen Experiments gezeigt. Schlussfolgerungen ZUSAMMENFASSUNG der Ergebnisse- Regulation der H.-pylori-stimulierten ODC in Makrophagen H.-pylori-induzierte Bindung von nukleären Proteinen an ODC-Promoter wird nicht durch cAMP verstärkt Effekt der Zugabe von cAMP auf H.-pylori-stimulierte Bindung von nukleären Proteinen an den ODC- Promoter.RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]- Lysaten (HPL; MOI: 100) für 2 h versetzt -/+ exogener Zugabe von zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). Nukleäre Proteine wurden extrahiert & inkubiert mit 32P-g-ATP-markiertem 133 bp-ODC- Promoterfragment (nt –264 bis –131 bp), was wir als bindend an H.-pylori-stimulierte nukleäre Proteine identifizierten. • PGE2 & cAMP sind allein nicht in der Lage ODC signifikant zu erhöhen, sie potenzieren jedoch die Induktion von ODC durch H. pylori. • Die Induktion von ODC wird teilweise durch COX-2 & PGE2 vermittelt. • Die Potenzierung der ODC-Promoteraktivität durch cAMP lässt sich eher durch erhöhte Bindungs-affinität von Transkriptionsfaktoren als von CREB-Proteinen begründen. • H. pylori induzierte gleiches zeitabhängiges Anstiegsverhalten der ODC-Promoteraktivität, -mRNA-Expression, -Proteinexpression & funktioneller Enzymaktivität mit „Peak“ bei 6 h. • COX-2-Expression, PGE2-Freisetzung & Erzeugung von cAMP zeigten signifikante Anstiege 4 h nach Stimulation. • Zugabe von PGE2 oder cAMP erhöhten die H.-pylori-induzierte ODC- Promoteraktivität, -mRNA-Expression & -Enzymaktivität. • Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 reduzierten signifikant die ODC-Aktivität. • cAMP beeinflusste nicht die Bindung nukleärer Extrakte von H.-pylori-stimulierten M an den ODC-Promoter. • Nukleäre Extrakte von H.-pylori-stimulierten Zellen banden auch nicht an eine Vergleichsprobe, die die „cAMP response element” Bindungs (CREB)-Seite enthielt (Daten nicht gezeigt).