1 / 17

Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników

Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników. E N D O G E N N E. E G Z O G E N N E. proc. zapalne. chemioterapia. oksydaza NADPH. promien. jonizujące. UV. peroksysomy. toksyny. mitochondria. H 2 O 2. OH ●. ONOO –. O 2 ● –. NO ●. Reaktywne formy tlenu.

davida
Download Presentation

Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metabolizm aerobowy = produkcja wolnych rodników E N D O G E N N E E G Z O G E N N E proc. zapalne chemioterapia oksydazaNADPH promien. jonizujące UV peroksysomy toksyny mitochondria H2O2 OH● ONOO– O2●– NO● Reaktywne formy tlenu Inhibicja proliferacji Osłabiona odpowiedź immunologiczna Homeostaza Generacja uszkodzeń Aktywacja szlaków sygnałowych

  2. Reaktywne Formy Tlenu USZKODZENIA I CHOROBY ROLA FIZJOLOGICZNA • aktywacjaERK1/2 • aktywacjaAP-1 • translokacja NFκB • aktywacjaPKC-α • peroksydacja lipidów • utlenianie cukrów i tioli • oksydacja DNA • uszkodzenia kwasów nukleinowych • starzenie • karcenogeneza • miażdżyca • choroby neurodegeneracyjne • odpowiedź zapalna • relaksacja mięśni gładkich • mitogeneza • apoptoza

  3. Obrona antyoksydacyjna NIEENZYMATYCZNA flawonoidy albumina metalotioneiny witaminy ACE melatoniny glutation ENZYMATYCZNA katalaza (CAT) peroksydaza glutationu (GPX) dysmutazy ponadtlenkowe (SOD)

  4. 0.1% - 2% pobieranego tlenu ulega konwersji do anionorodnika ponadtlenkowego (O2●–) SOD CAT O2●– H2O2 H2O + O2 GPX

  5. Manganozależna Dysmutaza Ponadtlenkowa (MnSOD, SOD2) • homotetramer – 88 kDa • zawiera jony Mn w miejscu aktywnym • zlokalizowana w błonie wewnętrznej mitochondrium • kodowana przez gen jądrowy • gen MnSOD jest złożony z 5 eksonów i 4 intronów E1 E2 E3 E4 E5

  6. MnSOD jest niezbędny • zwierzętaKNOCK-OUT • Li et al., 1995: • spowolniony wzrost • niewydolność fizyczna • kardiomiopatia rozstrzeniowa • powiększona wątroba • depozyty bałkowe w mięśniach szkieletu • Lebovitz et al., 1996: • spowolniony wzrost • niewydolność fizyczna • zaburzenia motoryczne • zmiany degeneracyjne w o.u.n. • uszkodzone i napęczniałe mitochondria wszystkie zwierzęta pozbawione genu MnSOD umierają przed 2 tyg. życia

  7. Konstrukt DNA użyty do wygenerowania nadekspresji MnSOD intron Myc tag MnSOD cDNA IRES EGFP GPX pTRE2hyg/SOD2ex plazmid ekspresyjny

  8. Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-OFF plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

  9. Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-ON plazmid regulacyjny P CMV tetR VP16 tTA +Dox (Tet) –Dox (Tet) tTA tTA MnSOD EGFP MnSOD EGFP TRE P CMV TRE P CMV plazmid ekspresyjny X X

  10. Zasady działania systemu regulowanej ekspresji - system tetracyklinowy Tet-OFF + plazmid ekspresyjny Tet-ON + plazmid ekspresyjny ─ Dox ─ Dox + Dox + Dox

  11. Regulowana nadekspresja MnSOD – system Tet-OFF expression ON expression OFF nadekspresja ekspresja fizjologiczna

  12. Regulowana nadekspresja MnSOD – potwierdzenie działania funkcjonalnego Western blotting z użyciem przeciwciała Anti-MnSOD 1 – komórki nietransfekowane 2 – transfekowane - Dox 3 – transfekowane + Dox Żel aktywności MnSOD 1 – nadekspresja 2 – kontrolna transfekc. 3 – bez transfekc.

  13. ĆWICZENIE pSuper-SOD2-RNAi

  14. Transfekcje komórek DNA użyty do transfekcji: Tet-OFF + SODex + pSuper Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi

  15. ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 1 Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 2

  16. ANALIZA FACS Tet-OFF + SODex + pSuper 3 Tet-OFF + SODex + pSuper-SOD2-RNAi 4

  17. Wprowadzić dyskusję nt. jak wykonać eksperyment naukowy do sprawdzenia wyciszania, aktywności Tg na poziomach mRNA i białkowym. Jak zaplanować eksperyment – jakie są potrzebne kontrole ?

More Related