Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

1. Cours d'Hémostase DUT ABB 3- Exploration de la Coagulation Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

2. Quand explorer la coagulation ? • Manifestations cliniques hémorragiques • Incident hémorragique per- ou post-opératoire • Bilan pré-opératoire • Thromboses • Surveillance traitement anticoagulant

3. Schéma simplifié de la coagulation Voie endogène Voie exogène Facteurs Contacts Facteur Tissulaire PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa VIIa PLCa2+VIIIa PLCa2+ X Xa PLCa2+ Va II IIa Fibrinogène Fibrine

4. Mesure du Temps de Quick (TQ) ou Taux de Prothrombine (TP): Exploration de Fonctionnalité Voie exogène Facteur Tissulaire • Réactifs: • Thromboplastine tissulaire = Facteur Tissulaire + PL • CaCl2 • Plasma VIIa PLCa2+ X Xa PLCa2+ Va II IIa Fibrinogène Fibrine

5. Thromboplastine tissulairecalcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Plasma 100µl TQ Préchauffage 2 min 37°c Caillot Fibrine Mesure du Temps de Quick Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et Ca2+ • N = 11-13 sec • Expression TQ en pourcentage Taux de Prothrombine (TP): besoin étalonnage Droite de Thivolle

6. TQ sec %TP 100 50 33 ( ) TQ Patient ISI INR= TQ Témoin Etalonnage: Mesure TQ sur Plasmas calibrés TP 100%, 50%, 33%,…. Droite de Thivolle • TP Pathologique si< 70% = TQ allongé • Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux surveillances de patients traités aux AntiVitamines K ISI: Indice de Sensibilité Internationale de la thromboplastine

7. Mesure du Temps de Céphaline + Activateur (TCA): Exploration de Fonctionnalité Voie endogène Facteurs Contacts • Réactifs: • Activateurs « Contacts »: Kaolin, Silice, Célite, Acide éllagique • Substitut PL: Céphaline • CaCl2 • Plasma PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa PLCa2+VIIIa X Xa PLCa2+ Va II IIa Fibrinogène Fibrine

8. TCA Patient > 1,2 TCA Témoin Mesure du Temps de Céphaline + activateur Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’activateur des facteurs « contacts », de PL et de Ca2+ CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Activateur 100µl TCA Préchauffage 3 min 37°c Plasma 100µl Caillot Fibrine • N: 30-35 sec • Résultat exprimé en secondes par rapport à un plasma Témoin normal • TCA allongé si ratio

9. Détection de la formation du caillot de Fibrine • « Lectures oculaires »  Barreau aimanté en rotation Technique du crochet accrochage caillot/filament gélatineux Bain-marie électromagnétique arrêt de rotation du barreau

10. Micro-cuvette en rotation Bille aimantée « Ergot central » Aimant • « Lecture électromagnétique » sur semi- ou automates complets Bille aimantée Micro-cuvette immobile Bobine électromagnétique Bobine électromagnétique Oscillation pendulaire de la bille ralentissement puis arrêt mouvement pendulaire par caillot fibrine Immobilité de la bille par aimantation emprisonnement dans caillot de fibrine provoque mise en rotation associée à la micro-cuvette

11. « Lecture optique » par turbidimétrie à 650 nm: moins utilisée • - DO départ: turbidité plasma (+réactifs) • -variation DO: addition réactif déclenchant • -variation DO: formation caillot fibrine

12. -Sur semi- ou automates complets, • Déclenchement chrono simultané à addition réactif « déclenchant » (Thromboplastine pour TQ, CaCl2 pour TCA) par pipette reliée électriquement • Arrêt Chrono automatique par détection caillot fibrine: • - arrêt mouvement pendulaire bille (diminution intensité champ magnétique) • - mise en rotation bille (coupure champ magnétique) • - changement de turbidité • -Sur semi-automates, • Addition manuelle: plasma, réactif, réactif « déclenchant » • -Sur automates complets, • Travail sur Tube primaire Sang centrifugé (Anticoagulant Citrate de Na+ 3,8%), tous les additions de réactifs sont automatisées

13. Allongement isolé TQ: • Déficit VII • Effet Inhibiteur : -thérapeutique: (présence héparine, en principe pas d’allongement sauf si [Héparine] importante), • début traitement Anti-Vitamine K • -pathologique: (Anticoagulants circulants) Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides • Allongement isolé TCA: • Déficit PK, KHPM, XII, XI, IX, VIII • Effet Inhibiteur: • -thérapeutique: héparine, et AVK • -pathologique: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides

14. Allongements associés TQ et TCA: • Déficit facteur voie commune: X, V, II, I • Dysfibrinogénémie • Déficits combinés:Vexo + Vc, Vendo + Vc, Vexo + Vendo (+ Vc) • Effets inhibiteurs: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides, Inhibiteurs polymérisation (PDF, anti-polymérase) • Inhibiteurs thérapeutiques: héparine, AVK

15. Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Plasma 200µl TT Préchauffage 2 min 37°c Caillot Fibrine Mesure du Temps de Thrombine (T T) Exploration de Fonctionnalité de la Fibrinoformation Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’une quantité standardisée de thrombine diluée et de Ca2+ • N  22 sec • Réalisé si TQ et TCA allongés • Si TT allongé: investigations supplémentaires (PDF, D-Dimères, Fibrinogène « immunologique »)

16. Allongements TT (et TQ et TCA) • Présence héparine • Déficit fibrinogène • Dysfibrinogénémie • Inhibiteur Fibrinoformation: PDF, Anti-polymérase

17. Temps de coagulation en sec. 1,5 3 6 Dosage chronométrique du Fibrinogène -dosage indirect, car mesure d’un temps d’apparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent -temps de coagulation à 37°C d’un plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène -dosage quantitatif et qualitatif -besoin étalonnage Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Déclenchement Chronomètre Plasma 200µl Caillot Fibrine Préchauffage 2 min 37°c Temps de coagulation Fibrinogène g/L • N : 2 à 4 g/L

18. Dosage chronométrique isolé de facteur de la coagulation -Plasmas réactifs déficients en un seul facteur -Temps de coagulation d’un plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester -Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux étalons

19. Dosage chronométrique facteur VIII Activateurs Facteurs contact CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl Stop Chrono Plasma déficitaire en VIII 100µl Déclenchement Chronomètre Temps de coagulation Préchauffage 3 min 37°c Caillot Fibrine Dilution Plasma Patient 100µl Temps de coagulation en sec. • Etalonnage %VIII N: 60-150% 15 45 95

20. Dosage chronométrique facteur VII Thromboplastine tissulairecalcique préchauffée à 37°C 200µl Stop Chrono Plasma déficitaire en VII 100µl Déclenchement Chronomètre Temps de coagulation Préchauffage 2 min 37°c Caillot Fibrine Dilution Plasma Patient 100µl Temps de coagulation en sec. • Etalonnage %VII • N: 70-130% 15 45 95

21. Dosage chromogénique isolé de facteur de la coagulation -Dosage colorimétriques (ou amidolytiques) -utilisation de substrats oligopeptidiques chromogènes: groupement paranitroaniline libère amine pNA par coupure enzymatique -dosage d’activité enzymatique: concentration enzyme (facteur) est proportionnelle à la vitesse d’hydrolyse, mesurée par la variation absorbance à 405 nm (dosage pt final, 2 pts, cinétique…)

22. Dosage chromogénique facteur VIII IXa + PL X Substrat CBS 48.03 CH30CO-D-Leu-Gly-Arg-pNA Dilution Plasma Patient 100µl DO à 405 nm 4 min 37°C 4 min 37°C 3 min 37°C IXa + PL VIII pNA X Xa DO 405 nm =[pNA] CBS 48.03 Etalonnage %VIII 25 50 100 200

23. Épreuve de correction de l’allongement isolé du TCA CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl Activateurs 100µl Stop Chrono Plasma Témoin N 100µl Préchauffage 3 min 37°c Déclenchement Chronomètre Plasma Patient 100µl TCA Caillot Fibrine Calcul Indice de Rosner (TCA Mélange – TCA Témoin N) x100 TCA Patient • Indice <12 : TCA Patient corrigé par Témoin: Déficits Facteurs • Indice >15: TCA Patient non corrigé par Témoin: Ac AntiCoagulants Circulants

24. TCA Patient-TCA Mélange % correction= x100 TCA Mélange • % correction > 65 %: déficit facteur • % correction < 50%: présence Ac anticoagulant circulant TCA Mélange Rapport= TCA Témoin N • Rapport < 1,2 : déficit facteur • Rapport > 1,2: présence Ac anticoagulant circulant