De la génomique aux outils de diagnostic rapides : Applications industrielles

1. De la génomique aux outils de diagnostic rapides :Applications industrielles Etat des travaux du projet BOARD Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers

2. ADRIA, centre de transfert technologique • Modélisation • Formulation, durée de vie, process • Microbiologie prévisionnelle  Qualité & sécurité de l’aliment au long de sa durée de vie • Outils de diagnostic • Détection, identification, traçabilité • Microbiologie, moléculaire  Hygiène de production, maîtrise des flores d’intérêt

3. Réponse à des attentes : développement de produit, i.e. expertises, outils, transfert ADRIA, centre de transfert technologqiue • Modélisation • Formulation, durée de vie, process • Microbiologie prévisionnelle • Outils de diagnostic • Détection, identification, traçabilité • Microbiologie, moléculaire

4.    Travaux en cours Perspectives & discussion (Re) émergence de bactéries • …Bactéries sporulées …Un bref état des lieux!

5. colonisation du tractus intestinal de volaille, porc • contamination des environnements primaires • augmentation de l’antibiorésistance des isolats2 • augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique chez les volailles suite à l’arrêt des antibiotiques comme facteurs de croissance3 Productions primaires • C. perfringens dans les élevages • les phénomènes de colonisation du tractus intestinal et de synthèse de toxines restent encore mal connus • Contamination des viandes…plats cuisinés et restauration collective3! 1 Craven SE et al. 2001, Avian dis 45:887-896 2 Tansuphasiri et al. 2005, Southeast Asia J Trop Med Public Health 36:954-961 3 Van Immerseel F et al. 2004, Avian pathol 33:537-549

6. Lait UHT Homologie des empreintes génétiques Lait cru Hétérogénéité des empreintes génétiques Productions secondaires • Bacillus Hautement Thermorésistant dans le lait UHT (HRS) • Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, B. sporothermodurans1,2 1 Scheldeman P et al. 2006, J Appl Microbiol 101:542-555 2 Olivier Guillaume-Gentil et al. 2004, Appl. Env. Microbiol 68:4216-4224

7. Bactéries HRS et acidophiles dans les pectines de fruit - Alicyclobacillus Productions secondaires • Bactéries HRS dans les produits appertisés • Moorella… • …Brevibacillus, Geobacillus stearothermophilus, • B. sporothermodurans, Paenibacillus

8. Productions secondaires • Bacillus psychrotrophes dans les produits pasteurisés, conservés au froid • groupe B. cereus émétique : B. weihenstephanensis 1 + 45 % entre 1999 et 2005 des produits réfrigérés prêts à l’emploi  - à noter : transfert du plasmide de B. anthracis vers B. cereus 2 1Thorsen L et al. 2006, Appl Environ Microbiol 72:5118-5121 2 Hoffmaster AR et al, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A. 101:8449-54.

9. Altérations! • Bactéries sporulées, sélectionnées par les process ou adaptées aux process… • ovoproduits • poudre de lait • produits pasteurisés conservés au froid • produits UHT • produits appertisés • …etc Adaptation ou sélection par le process ? Etude de prévalence et analyse des dangers

10. Prévalence et analyse des dangers • Quand la microbiologie fait défaut… • dénombrements des spores après traitement thermique • dénombrement de B. cereus • dénombrement de C. perfringens • Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Morella, Paenibacillus… Biodiversité de genres, d’espèces et de caractéristiques physiologiques, et donc de génomes!

11.    BOARD Perspectives & Discussion (Re) émergence de bactéries • …Bactéries sporulées  …Un bref état des lieux!

12. Filières impliquées BOARD • Bacilles thermorésistants: des Outils d’Analyses au Recensement des Dangers

13. Partenaires industriels Partenaires BBA (Bretagne Biotechnologies Alimentaires) animé par le Pôle Agronomique Ouest ADRO Ouest animé par le Pôle Agronomique Ouest Sociétés des produits de la mer et produits appertisés

14. PME Sylvie Hallier Patrice Chablain Partenaires industriels Stéphane Bonilla Centres R&D Ivan Leguérinel Florence Baron Sophie Jan Michel Gauthier Danièle Sohier Florence Postollec Partenaires

15. détection & identification aliment Développement d’un outil de diagnostic moléculaire BOARD : Objectifs permettant, à partir de matrice alimentaire ou ingrédient, - la détection & identification de bactéries sporulées - la détermination de leur prévalence en IAA pour une meilleure analyse des risques et évaluation des dangers

16. Programme R&D • Cahier des charges • Sélection des genres, espèces cibles • Alicyclobacillus, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus, Moorella, Paenibacillus • B. cereus, B. mycoides, B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringiensis, B. sporothermodurans, B. weihenstephanensis, B. laterosporus • Seuil de détection > 10/g et résultats à J1 • Enrichissement over-night • Outil multi-cibles, avec des contraintes de coûts • PCR multi-multicilbes plutôt qu’une biopuce….GeneDisc!

17. Protocole d’extraction 25g aliment + diluant Extraction Enrichissement 20h, 37°C Protocole d’amplification Extraction PCR temps réel Programme R&D • Protocole Objectif détecter une contamination < 10 spores/g

18. Programme R&D • GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes • Exploiter et séquencer ! Recherche de séquences cibles dans les bases de données & séquençage complémentaire • Valider l’identification de la collection pour les tests de spécificité • Valider les conditions d’enrichissement / Phylogénie • Séquences cibles…

19. 37°C ANaérobie Alicyclobacillus acidoterrestris C. perfringens Moorella thermoacetica Brevibacillus laterosporus 55°C ANaérobie Paenibacillus 30°C aérobie Anoxybacillus flavithermus Geobacillus stearothermophilus B. cereus 55°C aérobie 37°C +/- aérobie B. weihenstephanensis B. subtilis B. circulans B. licheniformis B. pumilus Programme R&D Arbre phylogénétique

20. 25g matrice + 100ml RCM Inoculation aux concentrations désirées 20h à 37°C anaerobiose 20h à 55°C anaerobiose 20h à 30°C aerobiose 20h à 55°C aerobiose Extraction Détection & identification par PCR en temps réel Programme R&D

21. Programme R&D • GeneDisc multi-cibles : Analyse des génomes • Analyses et alignement des séquences • Sélection de sondes oligonucléotidiques • Optimisation des mélanges réactionnels

22. GeneDisc1: Genres • Clostridium • Moorella • contrôles • Bacillus • Paenibacillus, Anoxybacillus • Geobacillus • GeneDisc2: Bacillus spp. • B. licheniformis • B. thuringiensis • B. sporothermodurans • B. weihenstephanensis • B. cereus • B. mycoides • B. pumilus • B. subtilis • contrôles • B. laterosporus • Bacillus Programme R&D • Deux GeneDisc

23. Programme R&D • Validation de la méthode • Inclusivité et exclusivité • Niveau de détection • Exactitude • Matrices artificiellement contaminées • Matrices naturellement contaminées : dénombrement des spores et identification par séquençage

24.   Travaux en cours Perspectives & discussion (Re) émergence de bactéries • …Bactéries sporulées  …Un bref état des lieux! 

25. Perspectives & discussion • Prévalence des flores sporulées et analyse des dangers • Evolution des GeneDisc en fonction de l’état des connaissances : description des espèces et acquisition de séquences • BOARD : exemple concret de la génomique aux applications industrielles ! …ANR MEMOSPORE

26. Horror vacui… • Bactéries sporulées : vers une adaptation aux process de production et de conservation ? • « La nature a horreur du vide. Mais d’autant qu’il ne saurait y avoir d’espace vide en aucun endroit de l’univers, et que les parties de la matière, étant rondes, ne sauraient se rejoindre si étroitement ensemble, qu’elles ne laissent plusieurs petits intervalles au recoin entre elles : il faut que ces recoins soient remplis de quelques autres parties de cette matière. » Descartes, Principa philosophiae, 1644 Merci pour votre attention!

27. florence.postollec@adria.tm.fr sbonilla@genesystems.fr