PROMĚNLIVOST BAKTERIÍ Fenotypové změny Genotypové změny Přenos genů Konjugace Transdukce

1. PROMĚNLIVOST BAKTERIÍ • Fenotypové změny • Genotypové změny • Přenos genů • Konjugace • Transdukce • Transformace • Extrachromosomální přenos • Restrinkce, oprava DNA • Genové manipulace

2. Historicky – názor o úplné plejomorfii • Později monomorfismus • Relativně velká proměnlivost bakterií: • reakce na vnější podmínky • rychlost množení • haploidní chromosom • Obecné genetické zákony platí i pro bakterie • Nyní bakterie významný objekt genetiky • Geny:chromosomální x extrachromosomální • Změny: • zasahující genotyp – jsou dědičné • zasahující fenotyp (= umožnění fenotypové realizace vlastnosti)

3. Fenotypové změny • Mají dočasný ráz • Reakce na vnější podmínky • Zasahují celý soubor (většinu buněk) • adaptivní enzymy – indukce enzymu substrátem • velikost buňky • přítomnost bičíků • disociace kolonií= změny morfologie kolonií spojené i se změnami některých vlastností, např.: • S – hlenovité – toxičtější, odolnější • R – drsné - méně virulentní i nižší toxicita • (u streptokoků 6 fází)

4. Genotypové změny – mutace • změny v uspořádání nukleotidů v DNA • Delece – zařazení- přesmyk… 1 či více párů • Mutace: spontánní x indukované • Mutageny - zvyšují frekvenci mutací: • chemomutageny (bromouracil…), radiační mutace (UV a γ záření) • Projev mutací vzhledem k haploiditě okamžitý (není recesivita) • Letální mutace znamenají okamžitou smrt buňky • Mutace - • dědičné (při replikaci přechází informace do dceřiných buněk) • diskontinuální (nárazovité) • řídké, zasahují malý počet jedinců, pravděpodobnost 1:106-109 • specifické – zasahují určitý determinovaný znak • nezávislé • mohou být spontánní (není známa příčina)

5. Přenos genů U vyšších organismů – sexuální procesy (zygota nositelem vlastností obou rodičů) U bakterií sexuální procesy nejsou Alternativou „parasexuální“ procesy Pro většinu hub důležitá součást životního cyklu 1. Konjugace= předání informace donora akceptorovi Podmínky: - rozdílnost buněk (přítomnost F plasmidu), sex-pily Etapy: - sex-pily vytvoří kanálek - F plasmid se „otevře“ (DNA není již kruhovitá) - jedno vlákno koncem 5´vstupuje do akceptora (může být přerušeno) - replikace – vznik 2. vlákna Hfr konjugace:Plasmid je součástí chromosomu a při přestupu může přenést i část chromosomální informace

6. Konjugace: Hfr konjugace:

7. 2. Transdukce= přenos genetické informace vektorem V přírodních podmínkách je hlavní vektor virus, který „omylem“ během své replikace přijal DNA hostitele Další vektory: plasmidy, kosmidy (umělé) Přenášena jen malá část DNA Pravděpodobnost: 1:106-108 Tři typy příjmu:- rekombinantní= fragment DNA se váže na chromosom - abortivní– DNA nevstupuje do chromosomu - plasmidový

8. 3. Transformace= buňka recipienta přijímá volnou DNA z vnějšího prostředí a zabudovává ji do chromosomu Pravděpodobnost menší – DNA relativně velká a může být v buňce rozložena endonukleasami vstup možný pro malý fragment (2000-5000 nukleotidových párů) 4. Extrachromosomální přenos genů= přenos zabezpečený plasmidy zvláště R Plasmid = dodatečná genetická informace Autoreplikační jednotka nezávislá na replikaci chromosomální DNA Výrazné zvýšení genetické variability Při dělení buňky variabilita přechodu plasmidů do dceřinných buněk; možná i ztráta (curing)

9. Oprava DNA, restrinkce = schopnost buňky opravit změněnou (poškozenou) DNA = podpora homeostase poškozený nukleotid (např. guanin metylací, či thymin zdvojením) je rozpoznán a změna je enzymaticky odstraněna bakterie mají regulační systém pro opravy = SOS regulon

10. Genové manipulace= řízená a cílená změna genomu • převážně založeno na transdukci • Fáze: • Získání genu • rozštěpení genomu donora restrinkčními endonukleasami (restrinktasami) • prostřednictvím mRNA – slouží jako matrice pro synthesu DNA reversní transkriptasou • synthesa genu podle jeho mapy (DNA synthetiser) • nákup genu • Výběr vhodného vektoru • nejčastěji R plasmid, nutná přítomnost vhodných markerů (resistence na antibiotika), • mapa plasmidu (znalost míst, kde je DNA plasmidu „otevřena“ restrinktasami • Konstrukce rekombinantního plasmidu • otevření plasmidu restrinktasou • vložení genu ligasou • výsledek: směs rekombinantních a původních plasmidů • Konstrukce rekombinantní buňky • plasmidy vstupují do buněk akceptora • výsledek: směs 3 typů buněk: • původní + s nezměněným plasmidem + s rekombinantním plasmidem • Výběr rekombinantní buňky • založen na využití márkerů • Klonování rekombinantní buňky • namnožení se sledováním stability nové vlastnosti • Vytvoření podmínek pro expresi genu • optimalizace prostředí a vnějších podmínek pro fenotypové uplatnění genu

11. Použití plasmidu pro klonování: 1. štěpení BAMHI restrinktasou 2. DNA ligasa 3. transformant resistentní A + T 4.transformant resistentní A citlivýT PSTI AMP RESIST.

12. Detekce rekombinantní bakterie (3 možnosti): - 0 nerezistentní - TC + AMP (pův. plasmid) - AMP (rekombinantní plasmid)