Tecnología de la fabricación de pasta y papel. Degradación biológica de la madera y de la pasta

1. Tecnología de la fabricación de pasta y papel. Degradación biológica de la madera y de la pasta J. Carlos Villar Gutiérrez villar@inia.es

2. El huempe o palo podrido

3. Enzimas fúngicas Celulasas Hemicelulasas: xilanasas, mananasas Ligninasas: lacasa, lignina-peroxidasa, Mn-peroxidasa Descomposición biológica de la madera Hongos de pudrición de la madera Pudrición blanda Pudrición parda Pudrición blanca

4. Pudrición Blanda • La pudrición blanda está producida, principalmente, por hongos ascomicetos y deuteromicetos. • Se da en condiciones de elevada humedad y se caracteriza por la aparición en la pared secundaria de la fibra de cavidades cilíndricas. • El nombre deriva del reblandecimiento producido en la superficie de la madera. • Los hongos degradan la celulosa y hemicelulosas. • Su modo de actuación es el ataque superficial de las fibras y su penetración hacia el interior una vez destruida la primera capa.

5. Pudrición Parda • La pudrición parda está causada por hongos de los géneros Lentinus y Phellinus, entre otros. • Degradan la celulosa y las hemicelulosas y dejan casi inalterada la lignina o provocan en ella degradaciones como la desmetoxilación. • Las hifas de estos hongos se encuentran en el lumen de la fibra desde donde pueden penetrar a otra fibra contigua a través de las punteaduras o por perforaciones causadas por su efecto. • El modo de ataque es desde la pared secundaria hacia la primaria y es más frecuente en las especies coníferas.

6. Pudrición Blanca • La pudrición blanca está causada, principalmente, por hongos basidiomicetos. • Afecta a todos los componentes mayoritarios de la madera: celulosa, hemicelulosas y lignina y con preferencia a las maderas de especies frondosas. • Este tipo de pudrición es el que centra el mayor interés del biopulpeo, en especial con aquellos hongos más selectivo para con la lignina. • El modo de ataque es desde el interior de las fibras hacia la superficie.

7. Hongos de pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium Coriolus versicolor Ceriporiopsis subvermispora Phebia subserialis

9. Hongos de pudrición blanca en la industria papelera • FPL (Madison) y STFI (Estocolmo) fueron pioneros en la búsqueda de soluciones biológicas para la industria de pulpa. • En la década de los 70 del siglo XX, Kirk y Kringstad (FPL) vieron que el pre-tratamiento de astillas de álamo con Rigidoporus ulmarius reducía el consumo de energía en el pulpeo mecánico. • En la misma época, Ander y Eriksson (STFI) publican por primera vez resultados sobre biopulpeo mecánico que muestran ahorros de energía con el pre-tratamiento fúngico de astillas. • Posteriormente se presenta en Estados Unidos la primera patente sobre biopulpeo por el grupo de Eriksson.

10. Biotecnología en la industria papelera • 1983 Los laboratorios del FPL aíslan del hongo Phanerochaetechrysosporium, la lignina peroxidasa, involucrada en la degradación de la lignina. • 1985 Investigadores del STFI buscan mutantes de Phanerochaetechrysosporium sin actividad celulolítica. • 198_ Creación del BiopulpingConsortium (EE.UU.) para el estudio del biopulpeo. Se abandona Phanerochaetechrysosporium, por Ceriporiopsissubvermispora. • 1986 El grupo de Viikari realiza el primer blanqueo con xilanasas en Finlandia (VTT ). En 1988 tiene lugar su primera aplicación industrial. • 1992 El grupo investigador de Farell aplica el hongo Ophiostomapiliferum(sin actividad ligninolítica) “Cartapip” al tratamiento de astillas para eliminar el pitch.

11. Pasta Mecánica de Refinador El refinador somete a las astillas a esfuerzos de compresión y de cizalla para separarlas. Elevado consumo de energía y roturas en las paredes de las fibras

13. Pycnoporus sangineus

14. Desfibrador Sprout Waldron  Medida del consumo específico de energía Kwh/t  Registro del consumo instantáneo de potencia Analizador de potencia

15. Degradación de madera de Picea abies por Streptomyces cyaneus. (a) Astillas no tratadas (b) astillas tratadas durante dos semanas Holzforschung, Vol. 59, pp. 173–177, 2005. M. Hernández, M. J. Hernández-Coronado, M. I. Pérez, E. Revilla, J. C. Villar, A. S. Ball, L. Viikari and M. E. Arias.

16. Efectos del Biopulpeo Mecánico • Degrada parcialmente la lignina • Reduce el consumo de energía • Elimina extractos de la madera • Oscurece ligeramente la pasta • Creación de grupos hidrófilos

17. Aplicación industrial del biopulpeo mecánico • Tiempos moderados de tratamiento • Inóculo económico • Evitar competencia de otros microorganismos • Mantener condiciones de fermentación • Controlar temperatura y humedad de la pila

18. Consorcio Biopulping • Viabilidad demostrada en laboratorio. • Probado con 4 t de astillas y con 40 t (pila a cubierto). • Se precisa: • Esterilización de las astillas (tratamiento con vapor) • Control de temperatura y humedad en la pila (aireación) Astillas tratadas 2 semanas con Ceriporiopsis subvermispora ahorra 25 - 30% de energía en los refinadores (entre 9-20 $/t considerando equipos y costes de operación) • Inconvenientes: • temperatura entre 27-32oC (precisa aireación) • produce hifas aéreas que limitan el flujo de aire • P. subserialis produce similares ahorros que C. Subvermispora pero crece a 27-39oC y no tiene hifas aéreas. La combinación de ambas cosas reduce costes de ventilación

19. Proceso de pasteado kraft Pulpeo Blanqueo Lavado de pasta Recuperación de Energía y Reactivos A máquina de papel

21. Biokraft Pulping BioresourceTechnology 95 (2004) 25–30 F. Wolfaardt, J.L. Taljaard, A. Jacobs , J.R. Male C.J. Rabie

22. Biokraft Pulping BioresourceTechnology 95 (2004) 25–30 F. Wolfaardt, J.L. Taljaard, A. Jacobs , J.R. Male C.J. Rabie

23. Selectividad y Deslignificación en el Biopulpeo Kraft • La degradación de la lignina va acompañada por la degradación de la celulosa y de las hemicelulosas. • Intentos para obtener mutantes de hongos ligninolíticos sin actividad celulasa condujeron a cepas sin capacidad ligninolítica destacable. • Las especies más selectivas para deslignificar necesitan tiempos de tratamiento muy largos (+10 semanas) • La alternativa es recurrir a tiempos más cortos y deslignificar en la cocción aprovechando las mejoras obtenidas.

24. Efectos del Biopulpeo Kraft • Para iguales condiciones de cocción, el pretratamiento fúngico reduce la lignina residual. • Equivalentemente, para la igual cantidad de lignina residual, el pretratamiento fúngico reduce el tiempo de cocción. • La deslignificación producida por el hongo en tiempo cortos de tratamiento no es muy marcada (-5%). • Las ventajas del tratamiento fúngico pueden derivarse de: (a) un mejora en la difusión de los reactivos de cocción y (b) un mejor uso de los agentes deslignificantes al eliminarse parte de la lignina y de los componentes minoritarios de la madera.

25. Eliminación del pitch (en pulpeo kraft) • El pitch está formado por extractos lipófilos de la madera y es causa de roturas, suciedad y defectos en la fabricación de papel. • Se puede evitar con el almacenamiento prolongado de la madera o con adición de dispersantes a las aguas de proceso. • En una aplicación biotecnológica de gran éxito, Farell y su equipo aplicaron el hongo Ophiostoma piliferum (sin actividad ligninolítica) a astillas. Eliminaron el pitch y elevaron la blancura de la pulpa. • Las lipasas hidrolizan los triglicéridos del pitch para dar lugar a ácidos grasos y glicerol. Esta aplicación permite usar madera fresca y está comercializada. Probada en Nippon Paper (1990). • Las soluciones biotecnológicas para eliminar el pitch también han sido eficaces enel pulpeo químico (los compuestos del pitch consumen también reactivos de cocción) reduciendo la lignina residual como sucede con los hongos ligninolíticos.

26. Retos del Biopulpeo • Microorganismos • Aumentar su selectividad • Especies que trabajen a mayor temperatura • Proceso • Reducir cantidad de inóculo • Mantener esterilidad y temperatura • Cambio de escala • Mejorar la economía del proceso

27. Wood chips Bleaching Beating Chemical pulp Trees Waste water Papermaking Beating Deinking Bleaching Recycled fibers Uso de enzimas en la industria de pastas kraft y del papel Xylanases Cellulases as Beating aid Dissolving pulp Cellulases for Enhance dewatering Pulp Amylases for reducing starch viscosity In coating Enzymes in deinking

28. Celulasas • La degradación de la celulosa es llevada a cabo por enzimas denominadas celulasas capaces de hidrolizar enlaces o-glicosídicos cuando estos se encuentran en el interior de la molécula. • Así liberan disacáridos (celobiosa) que son degradados hasta glucosa a través de disacaridasas. • La glucosa es una molécula capaz de incorporarse a la ruta metabólica de la glicólisis y servir de fuente energética para el microorganismo, o servir como constituyente para que éste forme sus propias estructuras.

29. Hemicelulasas • En la degradación de las hemicelulosas participan diversas enzimas, como las xilanasas, capaces de liberar los distintos azúcares que forman este biopolímero. • Los azúcares también pueden incorporarse a la vía glicolítica y ser degradadas o emplearse en la construcción de los polisacáridos fúngicos.

30. Enzimas degradadoras de lignina • Se sabe que estos hongos son capaces de degradar completamente la lignina hasta CO2 y agua, pero no se conocen con detalle las rutas • En las peroxidasas (Lignina peroxidasa y Mn peroxidasa) el agua oxigenada es el aceptor final de los electrones sustraídos a la molécula aromática. • LiP es un oxidante inespecífico que cataliza la oxidación de fenoles. • MnP con efecto similar pero de acción más suave • Para la acción de las peroxidasas es imprescindible la presencia de enzimas productoras de peróxido: glioxal oxidasa, glucosas oxidasa y aril alcohol oxidasa

31. Enzimas degradadoras de lignina. Lacasas Las lacasas o difenoloxidasas son oxidasas capaces de oxidar difenoles a las correspondientes quinonas. Usan O2como sustrato aceptor de electrones y lo reducen hasta agua. Oxida compuestos fenólicos e incluso no fenólicos si hay compuestos intermedios Diversas quinona reductasas estabilizan los radicales formados por las enzimas oxidativas e impiden así su repolimerización Sitio activo con 4 Átomos de Cu, los cuales reducen O2 a H2O capturando e- del sustrato

32. Bioblanqueo Degrada la lignina Reduce la necesidad de reactivos de blanqueo Facilita el blanqueo químico posterior Evita la contaminación por vertidos y facilita su tratamiento Precisa de mediadores (Lac) Degradación de la celulosa Temperatura moderada Coste de las enzimas

33. Bioblanqueo con Xilanasas • La aplicación de xilanasas hidroliza los enlaces entre la matriz de hemicelulosas y la lignina • Actúa en superficie (no hay problemas estéricos) • Libera compuestos cromóforos • Mejor acceso de los reactivos de blanqueo (bleaching booster) • Eleva la blancura de la pasta • Disminuye el gasto de reactivos • Menor generación de cloroligninas (si es el caso)

34. Bioblanqueo con Xilanasas • El intervalo de pHóptimo varía con la procedencia de la xilanasa. Deseables enzimas que actúen a pH alcalino. • Temperaturas moderadas (40 - 60ºC). Temperaturas mayores son beneficiosas. Algunas xilanasas son estables durante varias horas a temperaturas próximas a 90ºC. • El tiempo de aplicación se puede prolongar varias horas si la estabilidad de la xilanasa lo permite. Limitado por la presencia de celulasas. • Debe buscarse la dosis óptima de enzima en cada caso. Suele estar entre 1 y 5 UI/ g de pasta. • La consistencia de la pasta está en torno al 10%. Debe asegurarse una mezcla eficaz de la pasta con los reactivos.

35. Ventajas Inconvenientes Condiciones Aumento de blancura Menor consumo de reactivos Menos contaminación Degradación de celulosa Pérdida de rendimiento Menor resistencia mecánica Temperatura: 40-60ºC pH: 6-9 Tiempo: 1-3 horas Dosis: 1-5 UI/g pasta Bioblanqueo con Xilanasas

36. Bioblanqueo con Peroxidasas La enzima MnP provoca la degradación de la lignina mediante la acción del manganeso, al que oxida de Mn2+ a Mn3+, siendo este último el oxidante de la lignina. Solo actúa sobre unidades fenólicas No obstante, en presencia de ciertas sustancias se ha mostrado eficaz para oxidar compuestos modelo de lignina no fenólicos. Se ha sugerido que la MnP oxida el doble enlace C=C a un radical peróxido, que es el oxidante de las estructuras no fenólicas tipo lignina. Es decir, este radical realiza ahora la función que el Mn3+ hacía en la oxidación con MnP sin mediador.

37. Bioblanqueo con Lacasas Las lacasas pueden clasificarse de acuerdo a su potencial redox, encontrándose las de mayor potencial en hongos de pudrición blanca. Las diferencias en el potencial redox se deben a la estructura de las proteínas. Las lacasas fúngicas presentan la ventaja, respecto a las peroxidasas LiP y MnP, de su mayor termoestabilidad. El uso de lacasas para deslignificar pastas kraft está limitado por el tamaño de la enzima que dificulta su penetración al interior de las fibras.

38. Bioblanqueo con Lacasas Imposibilidad? de oxidar sustratos no fenólicos. En presencia de compuestos apropiados de bajo peso molecular (mediadores) las lacasas son capaces de oxidar una amplia variedad de compuestos modelo. Los mediadores actuarían como transportadores de electrones, inhibiendo la repolimerización de los radicales oxidados.

39. Bioblanqueo con Lacasas El "sistema lacasa-mediador" (SLM) descrito por Bourbonnais y Paice, oxida sustratos no fenólico empleando la sal de diamonio del ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina sulfónico (ABTS) como mediador.

40. Bioblanqueo con Lacasas En un primer momento, la lacasa sería activada por una molécula de oxígeno. La lacasa activada oxidaría entonces al mediador y recuperaría su estado inicial. La secuencia prosigue con el mediador activado que se difunde hacia la lignina y es, en realidad, el oxidante real. La actividad del sistema lacasa mediador hacia la lignina depende de: el potencial redox de la enzima y la estabilidad y reactividad del radical generado por la oxidación del mediador.

41. Ventajas Inconvenientes CondicionesGenerales Aumento de blancura Menor consumo de reactivos Menos contaminación Necesidad de mediadores Baja deslignificación (MnP) Mn P Tª: 25-30ºC pH: 4,5 Tiempo: 3-24 horas Dosis: 50-100 U/g pasta Lac Tª: 45-50ºC pH: 3,5-5,8 Tiempo: 2-4 horas Bioblanqueo con Mn Peroxidasa/Lacasa

42. Retos del Bioblanqueo Alcanzar el bioblanqueo total (sin etapas de blanqueo químico) Búsqueda de enzimas más eficaces En blanqueo con Lac encontrar mediadores eficaces, baratos y no contaminantes Limitar la degradación de la celulosa Mejorar la economía del proceso