CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP5

1. PRELUCRAREA PRELEVATELOR PATOLOGICETEHNICI DE INSAMANTARE PENTRU IZOLAREA SI IDENTIFICAREA BACTERIILOR CATEDRA DE MICROBIOLOGIE LP5

2. Insamantarea prelevatelor patologice, in functie de natura lor, se realizeaza: • direct sau • dupa o prealabila prelucrare (concentrare, decontaminare, omogenizare, inactivarea unor substante antimicrobiene)

3. Prelevatele omogene, fluide – sange, exsudate seroase prelevate pe anticoagulant, puroi • Prelevatele emulsionabile - materii fecale - se pot insamanta direct

4. CONCENTRAREA PROBELOR • Centrifugare – probele fluide • Omogenizare - sputa

5. DECONTAMINAREA PROBELOR • Spalare in solutie salina izotona – utila pentru: • sputa muco – purulenta, • portiunile muco – sangvinolente din scaun • Tratarea cu NaOH: • decontamineaza probele pentru izolarea micobacteriilor • fluidifica si omogenizeaza sputa

6. OMOGENIZAREA PROBELOR • Omogenizarea sputei pentru izolarea bacteriilor neacido – alcoolo – rezistente: • se realizeaza cu N – acetil – cisteina. • Omogenizarea tesuturilor: • se realizeaza prin mojarare in tub Griffith

7. TEHNICI DE INSAMANTARE • Epuizareainoculului cu ansa pe placi cu mediu agarizat si obtinerea culturilor pure necesare identificarii • initial, este necesara “uscarea placilor”, prin mentinerea placilor ~ 30 min. la 37°C, cu capacul Intredeschis – pentru evaporarea condensului de pe suprafata mediului

8. TEHNICI DE INSAMANTAREEpuizareainoculului • pe placile cu medii agarizate neselective, uzuala este izolarea prin epuizare semicantitativa a inoculului in 4 cadrane, cu arderea ansei cand schimbam directia striurilor de insamantare. - metoda permite aproximarea relativa a cresterii.

10. TEHNICI DE INSAMANTAREEpuizareainoculului • pentru izolari pe medii selective, cantitatea de inocul trebuie sa fie mai mare, iar epuizarea mai putin drastica. • initial, se etaleaza in aria A una sau mai multe anse cu inocul ori inocul prelevat pe tampon. • epuizam apoi inoculul, fara sterilizari intermediare ale ansei, prin 3 serii de striuri: B, C, D.

12. TEHNICI DE INSAMANTAREEpuizareainoculului • cantitatea de fluid prelevata in ansa difera cu pozitia de scufundare si retragere a ansei: • cantitate minima si constanta - la scufundarea si retragerea verticala • cantitate maxima – la scufundare cat mai oblica si retragerea ansei prin “smulgere” din fluid

13. TEHNICI DE INSAMANTAREEpuizareainoculului • Cultura pura – acea cultura formata din descendentii unei singure colonii rezultate dupa o epuizare a materialului microbian, care duce la cresterea sub forma de colonii bine izolate pe un mediu neselectiv.

14. TEHNICI DE INSAMANTAREEpuizareainoculului • Ideal, ar fi ca asemenea crestere sa porneasca de la indivizi izolati. • Practic ea porneste de la unitati formatoare de colonii (UFC) – poate indivizi, poate o mica grupare de organisme asemanatoare.

15. TEHNICI DE INSAMANTARE 2. Insamantarea in medii lichide se face: - direct cu seringa de prelevare (hemoculturi) - cu pipeta (sedimentul LCR) - cu ansa incarcata cu prelevat patologic monomicrobian ori cultura pura

16. TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea in medii lichide • inclina tubul si descarca ansa pe peretele tubului • cand readucem tubul la pozitia verticala, inoculul ajunge submers si difuzeaza in mediu.

17. TEHNICI DE INSAMANTARE 3. Izolarea bacteriilor sporulate de cele nesporulate pe baza termorezistentei sporilor.

18. TEHNICI DE INSAMANTARE Izolarea bacteriilor sporulate • Mentine in baia de apa la 80 °C, timp de 10 min., produsul microbian suspensionat in solutie salina izotona, apoi epuizeaza suspensia pe o placa cu mediu agarizat.

19. TEHNICI DE INSAMANTARE 4. Insamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta. Indicatii: - mentinerea pe durata limitata (cateva zile / 1 - 2 saptamani) a culturilor pure (ex.: tulpini de identificat, tulpini de referinta)

20. TEHNICI DE INSAMANTAREInsamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta • preleva cu ansa inocul din mai multe colonii ale culturii purificate pe placa cu mediu agarizat. • depune inoculul in partea inferioara a pantei, imediat deasupra apei de condens si retrage ansa spre partea superioara a pantei descriind miscari in “S” pe suprafata mediului.

21. TEHNICI DE INSAMANTAREInsamantarea cu ansa a mediilor solidificate in panta • izolarea in cultura pura a tulpinilor de Proteus din prelevate contaminate. • descarca o ansa din prelevatul patologic strict in apa de condens a tubului. • incubeaza tubul in pozitie verticala. • singura, cultura de Proteus va invada prin “catarare” suprafata pantei de mediu.

22. TEHNICI DE INSAMANTARE 5. Insamantarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale. Indicatii: • testarea mobilitatii bacteriilor • conservarea pe durate mai lungi (1 – 6 luni) a tulpinilor bacteriene

23. TEHNICI DE INSAMANTARE Insamantarea cu firul drept a coloanei de agar nutritiv moale • incarca firul cu inocul din cultura pura si inteapa central coloana de agar nutritiv pana aproape de fundul tubului. • la testarea mobilitatii retrage acul cat mai exact pe acelasi traiect pentru a evita dilacerari suplimentare ale mediului in care cresterea poate da impresia falsa de mobilitate a bacteriei.

24. TEHNICI DE INSAMANTAREInsamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta. 6. Insamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta. Indicatii: - testarea unor activitati biochimice

25. TEHNICI DE INSAMANTAREInsamantarea cu firul drept a mediilor solidificate in coloana si panta. • Incarca firul cu inocul din cultura pura si procedeaza mai intai la insamantarea prin intepare a coloanei, apoi retrage acul, insamanteaza prin miscari in “S” pana in partea sa superioara.

26. TEHNICI DE INSAMANTARE 7. Insamantarea uroculturilor se realizeaza cu ansa calibrata de 10 µl. pentru a estima semicantitativ concentratia bacteriana / ml. urina