1 / 16

DNA diagnostika syndromu

DNA diagnostika syndromu. prodlouženého QT intervalu. Kadlecová J. 1 , Ravčuková B. 1 , Grochová D. 3, Gaillyová R. 1 , Novotný T. 2 a Semrád B. 2 1 odd. lékařské genetiky, FN Brno 2 interní kardiologická klinika, FN Brno 3 PřF MU Brno. Long QT syndrom (LQT).

dyanne
Download Presentation

DNA diagnostika syndromu

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNA diagnostika syndromu

  2. prodlouženého QT intervalu

  3. Kadlecová J.1, Ravčuková B.1, Grochová D.3, Gaillyová R. 1, Novotný T. 2 a Semrád B.2 1odd. lékařské genetiky, FN Brno 2interní kardiologická klinika, FN Brno 3 PřF MU Brno

  4. Long QT syndrom (LQT) • Dědičná kardiologická choroba charakterizovaná prodloužením repolarizace myokardu, které zvyšuje riziko maligních komorových arytmií a tím i synkop a náhlého úmrtí. Klinické projevy LQTsy • poruchy srdeční činnosti * ventrikulární tachyarytmie (torsade de points) * ventrikulární fibrilace * synkopy • sy náhlého úmrtí • prodloužení QT intervalu na EKG (obr.1)

  5. Obr.1: EKG z ergometrického vyšetření (50mm/s, 20mm/mV) dokumentující dynamiku chování LQT vlevo výrazné prodloužení QTc u pacienta, vpravo fyziologická zkrácení QTc u zdravého jedince

  6. Formy LQT sy • podle dřívějšího rozlišování: - Romano-Ward syndrom s dědičností autozomálně dominantní - Jerwell a Lange-Nielsen syndrom (JLN) s dědičností autozomálně recesivní, navíc charakterizovaný poruchou sluchu • dnes jsou tyto syndromy chápány jako společné fenotypové vyjádření nejméně 9 geneticky odlišných nozologických jednotek ( tab.1)

  7. Tab.1 : Typy LQTs ve vztahu ke genům a jejich produktům , - podjednotky iontových kanálů

  8. Mutační analýza genu KVLQT1 a genu HERG • ) KVLQT1 gen • lokus - 11p15.5 • KVLQT1 gen -350 kbp, 16 exonů • produkt KVLQT1 genu: K+kanálová  podjednotka (IKs), nezbytná pro depolarizaci srdečních iontů. Protein sestává z 6 transmembránových domén S1 - S6 a jedné domény: póry viz schéma 1 • ) HERG gen • lokus - 7q35-36 • HERG gen - 19 kbp, 16 exonů • produkt HERG genu: K+kanálová  podjednotka (Ikr), sestávající z 6 transmembránovýchsegmentů(S1-S6), jedné oblasti póru (P) a nukleotid vazající domény(cNBD), viz schéma 2 Mutace v genech KVLQT1 (42%) a HERG (45%) představují většinu nalezených mutací u LQT pacientů ( 87 % dosud identifikovaných mutací)

  9. Schéma 1: KVLQT1: K+kanálová  podjednotka (Splawski et al., 2000) Schéma 2: HERG:K+kanálová  podjednotka (Splawski et al., 2000)

  10. Schéma 1: Iontový K+kanál složený z proteinu KVLQT1 a minK P Kanál obsahuje 4 KVLQT1 podjednotky z nichž každá má 6 transmembránových segmentů (S1-S6) a oblast póru (P) tvořící funkční kanál Schéma 2: Iontový K+ kanál HERG P HERG protein obsahuje 6 transmembránových jednotek, oblast póru(P) a nukleotid vázající domény (cNBD) Převzato z: Wang, Q. et al., 1998, Molecular Medicine Today

  11. Protokol mutační analýzy KVLQT1/HERG genu u LQT pacientů • genetická poradna • informovaný souhlas pacienta • odběr krve, izolace DNA • multiplex PCR - syntéza 16 exonů KVLQT1/ HERG genu ve 4 PCR reakcích • multiplex SSCP analýza (metoda jednořetězcového konformačního polymorfismu) • SSCP jednotlivých exonů (při nálezu změny mobility • DNA fragmentu v multiplex SSCP) • potvrzení a verifikace sekvenční změny sekvenováním na ABI Prism 310 • detekce potvrzené mutace u ostatních členů rodiny

  12. ex.10 ex.9 ex.7 ex.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Multiplex PCR oblast II ( ex.5, 7, 9 a 10 genu KVLQT1) legenda: 12% PAGE (40:1), 150V/16hod/ 15°C dráha 1: marker molekulových hmotností pBR322/Alu1 dráha 2-8: multiplex PCR ( LQT pacienti) dráha 9: multiplex PCR (kontrolní DNA)

  13. Multiplex of SSCP(exons 5, 7, 9, 10 of KVLQT1gene) 15°C 4°C +ssDNA(mt) -ssDNA(mt) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 B) 12% PAGE(40:1), 150V/16h./15°~4oC line 1: control DNA lines 2 -5: DNA of LQT patients mt ssDNA: single strand mutant DNA A) Principle of SSCP

  14. SSCP exonu 7při nálezu změny mobility v multiplex SSCP + ssDNA(wt) Legenda: 12% PAGE (40:1), 150V/16hod./15°C dráhy1,2,4,5,8: DNA pacientů LQT v rámci jedné rodiny dráhy 3,6,7: DNA zdravých členů rodiny -ssDNA (mt) - ssDNA(wt) 1 2 3 4 5 6 7 8 sekvenace aberantního DNA fragmentu DNA pacienta: nalezená mutace G325R (Gly >Arg) v heterozygotním stavu

  15. ZÁVĚR • Presymptomatická diagnoza LQTsyje především založena na prolongaci QT intervalu v EKG. Spektrum QTc intervalů u nemocných a zdravých jedinců se značně překrývá , což může vést k chybné klasifikaci LQTs. Genetický screening je důležitý pro klinickou diagnózu a léčbu LQTs. Přítomnost mutace odliší jedince s rizikem vývoje choroby a identifikuje odpovědný gen jak v LQT rodinách, tak i u sporadických případů. • Screening mutací KVLQT1genu v našem souboru 27 jedinců odhalil sekvenční změny ve 46% případů. Nalezené sekvenční změny verifikované sekvenační analýzou shrnuje tabulka 2. Práce je podpořena grantem IGA MZ NA 5718-3

  16. Tab.2: Spektrum mutací zachycených SSCP analýzou KVLQT1/HERG genů u 27 LQT pacientů S6--c: C-terminalní oblast k S6 SNP : single nucleotide polymorphism

More Related