Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes

1. Étudier le métabolisme a l'état stationnaire une approche par contraintes Julien Gagneur doctorant Grenoble, 6 Mai 2004

2. Substrats du milieu Molécules propres Briques élémentaires Cofacteurs Métabolisme Régulation Motivation • On cherche à « explorer différentes approches pour l'étude intégrée des réseaux géniques et métaboliques » • On se restreint à une cellule.

3. Motivation = E. coli: •  750 réactions •  500 métabolites Roche Applied Science « Metabolic Pathways » map

4. Motivation • Le « plan » est complet pour certains micro-organismes (H. influenzae, E. coli) • Par séquençage et annotation de génome, en cours pour d’autres micro-organismes (KEGG) • Il existe des modèles des réactions enzymatiques (MCA) • MAIS: Il est difficile d’estimer in vivo: • Les lois cinétiques • leurs paramètres • les concentrations des métabolites

5. Motivation • Des données structurelles, certes, mais (presque) complètes à l’échelle cellulaire • Que peut-on dire sur le métabolisme à partir du réseau seulement ou à partir du réseau et de quelques mesures? • Approche par contraintes

6. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

7. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

8. Construction du modèle • Système • Métabolites • Internes m=6 • Externes • Flux (réactions +transports): q=10 • Stœchiométrie : (Klamt et al, 03)

9. La matrice de stœchiométrie N • N est un composant essentiel du système dynamique • La dynamique du système est décrite par (MCA): c(t) : concentrations r(t) : flux des réactions (reaction rates) contient les paramètres cinétiques N invariant du système contient sa structure N matrice creuse

10. r1 r4 r2 Metabolite r5 r3 Hypothèse d’état quasi-stationnaire Les métabolites ont un temps de turn-over typique  rapide par rapport à la régulation Le métabolisme est à l’état quasi-stationnaire (quasi steady-state) } Pour les métabolites internes: Production = Consommation c(t) const.

11. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

12. Metabolic Flux Analysis Détermination d’une distribution de flux lors d’une expérience à l’état stationnaire L’ équation Nr = 0 est souvent indéterminée (q>m : plus de réactions que de métabolites)  certains flux doivent être connus par mesures par hypothèses Soit: - k (known) les indices des flux connus - u (unknown) les indices des flux inconnus

13. Metabolic Flux Analysis La solution utilisée est basée sur la matrice pseudo-inverse de Moore-Penrose qui résout le problème des moindres carrés: -pour les cas sur-déterminé (moindres erreurs) -pour les cas sous-déterminé (solution parcimonieuse)

14. r2 r1 r4 B A r3 2 B A 2 0 2 2.5 2 3 B A Metabolic Flux Analysis Connu inconnu 0 2 B Déterminé A 2 Sur-déterminé Sous- déterminé les flux manquants peuvent être estimés par: - pseudo-inverse (longueur minimale) - optimisation d’autres objectifs (croissance maximale…)

15. MFA: Utilisation • Avec les flux externes: souvent insuffisant • Combines avec des mesures (partielles) des flux internes Isotopic Tracer Experiment (Wiechert et al.)

16. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Premiers pas • Ce que l’on pourrait faire (propositions)

17. Irréversibilité de certaines réactions Certaines réactions, dans les conditions de fonctionnement de la cellule, sont unidirectionnelles. Les flux associés sont positifs ou nuls.

18. Construction du modèle (suite) • Flux (réactions +transports): q=10 • Rev={R2,R8} • Irrev={R1,R3,R4,R5, R6,R7,R9,R10}

19. Le cône des états possibles • Les états possibles obéissent à un ensemble de contraintes linéaires: • m égalités : • |Irr| inégalités : • Cela restreint toute solution • dans un cône polyédrique convexe

20. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

21. Flux Balance Analysis Détermination d’une distribution de flux optimale à l’état stationnaire pour une fonction objectif donnée On considère un problème d’optimisation linéaire: • État stationnaire Sous contrainte: • réversibilité et capacité • Exemples: • réaction irréversible : i=0 • flux maximal connu (capacité) : bi=Vmax • conditions du milieu : i= bi=0 Problème standard et rapidement résoluble Le argmax n’est pas unique !

22. FBA: fonction objectif • Suivant l’idée que l’évolution a conduit à des « organismes optimaux »: • croissance maximale (maximal growth) • rendement d’ATP • « metabolic engineering »: optimisation d’organisme • rendement maximal pour un certain produit • Minimisation de produits secondaires

23. “manière optimale de produire P en présence de A seulement dans le milieu ?” FBA: exemple Max cTr = (0,0,1,0,0,0,0,0,0,0) r Sous: Nr =0 i = (0,-,0,0,0,0,0,-,0,0) i = (1,0,+,+,+,+,+,+,+,+) Rendement optimal = R3/R1= 1

24. FBA: application et variante • Prédiction du taux de croissance optimal (et observation !) (Edwards et al., Ibarra et al. ) • Identification de rendement optimaux • (Nielsen et al., Stephanopoulos et al. ) • Prédiction de viabilité de mutants (Edwards et al.) • Invalidation de réseaux • Une variante pour les mutants: MoMA Minimization of Metabolic Adjustment Le mutant serait à un état sous optimal mais voisin de l’état optimal de la souche sauvage (Segre et al.) • Simulation dynamique

25. Solution (2) Solution (1): P/A=1 Solution (3) FBA: Limitations • « fonction objectif naturelle » • les organismes sont-ils optimaux? • Pour quel objectif? • la solution optimale n’est pas unique! • Pas de prédiction certaine de la distribution des flux

26. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

27. Metabolic Pathway Analysis Définition de la notion de « voie métabolique » comme route fondamentale fonctionnelle a l’équilibre. L’idée part du cône (espace des réactions): Tout r admissible est combinaison à coefficients positifs des rayons extrêmes rayons extrêmes = base convexe Problème : le cône n’est pas toujours pointé (réactions réversibles) espace linéaire Pour avoir une définition canonique : 2 voies…

28. MPA: Extreme Pathways Par reconfiguration du réseau L’idée classique: pour toute variable libre x, on pose: x = x+ - x- x+ >=0 ; x- >=0 Toute réaction réversible est partagée en 2: forward et backward Rf R A B = A B Rb et : cône pointé Extreme pathways = extreme rays

29. MPA: Elementary Flux Modes En se basant sur une propriété des rayons extrêmes Tout rayon extrême satisfait un maximum de contraintes avec égalité (maximum au sens de l’inclusion) Dans le cas irréversible: Toujours satisfaites avec égalité Un maximum avec égalité  un minimum de réactions utilisées Cas général: Elementary Flux Mode = une distribution de flux minimal (pour l’inclusion) en terme de réactions utilisées

30. MPA: 2 voies = 1 voie En fait, extreme pathways = elementary flux modes • Sauf: • bi-cycle futile (futile 2-cycle) Rf A B (extreme pathway) A B Rb • problèmes de convention a l’interface (flux entrants et sortants) pour les extremes pathways: certains pathways optimaux peuvent être omis • utiliser les Elementary Flux Mode

31. ensemble des solutions optimales pour P/A MPA: exemple R6 et R9 sont parfaitement corrélées (Klamt, 03)

32. MPA: applications et limitations • Identification de « voie métabolique »: Base qui engendre toute solution admissible • Contient une base pour les solutions optimales aux problèmes linéaires • Corrélations de réactions • Définition des délétions létales minimales (minimal cut set) • Flexibilité du réseau (par le nombre d’EFMs) • Limitation: explosion combinatoire Métabolisme central d’E.coli (109 réactions, 500 000 EM)

33. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • propositions

34. MFA MPA FBA rFBA ? J.P. Modèles intégrés? vue d’ensemble Quantités / temps réseau

35. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Balance Analysis • proposition

36. Regulatory Flux Balance Analysis La régulation contraint le métabolisme • Covert, Palsson « transcriptional regulation in constraints-based metabolic models » J. Bio. Chem. 2002 • Réseau génique modélise comme un réseau booléen, qui réagit a la présence ou absence de métabolites internes ou externes. • A une condition fixee par le reseau genique, FBA est appliquee • Amélioration de la prédiction de viabilité de simples mutants • (de 97 a 106 sur 116 ) • Amélioration des modèles dynamiques

37. Plan • Analyses du métabolisme par contraintes • État quasi-stationnaire • Metabolic Flux Analysis • Irréversibilité • Flux Balance Analysis • Metabolic Pathway Analysis • Vers des modèles intégrés des réseaux géniques et métaboliques? • Vue d’ensemble • Regulatory Flux Blance Analysis • proposition

38. Proposition Le métabolisme contraint la régulation • Quels degrés de liberté reste-t-il au réseau génique étant donné le réseau métabolique? • gène constitutivement exprime? • logique du réseau? un exemple : enzyme subset

39. Exemple: cascade A B C A B Enzyme subset Ensemble de réactions qui opèrent a ratio de flux fixe 2 a 2 a l’état stationnaire. Ou correlation plus “distante” • Pour l’instant détecté au sein du noyau de N comme lignes colinéaires • utilise pour réduire les modèles • « vraisemblablement coregules »

40. Menaquinone synthesis operon Enterochelin synthesis operon Proposition • A quel point peut-on prédire des opérons par contraintes structurelles issues du métabolisme? • Des structures logiques plus complexes (OU) comme un iso-enzyme ?

41. Références (points d’entrée) Metabolic Flux Analysis: Klamt et al. 2002« Calculability analysis in underdetermined metabolic networks illustrated by a model of the central metabolism in purple nonsulfur bacteria. » Biotechnol Bioeng. Mar 30;77(7):734-51 Flux Balance Analysis: Edwards et al 2001 « In silico predictions of E. coli metabolic capabilities are consistent with experimental data » Nature Biotech. 19:125-130 Metabolic Pathway Analysis: Klamt, Stelling 2003 « Two approaches for metabolic pathway analysis? » Trends in Biotech. 21 (2):64-69