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Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras

Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras . Djalma Jonilson Jaqueline. Origem de células T reguladoras no timo e na periferia. Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622. Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3.

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Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras

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Presentation Transcript

  1. Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline

  2. Origem de células T reguladoras no timo e na periferia Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622

  3. Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3

  4. Existe uma rede transcricional que determina a expressão de foxp3 e outros genes relacionados às células T reguladoras?

  5. Identificação molecular, estrutura e padrão de expressão do gene fkh(fox) • As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo • e portanto podem agir como um reguladores transcricionais

  6. Subfamílias das protíenas Fox • 15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia 6 Kaestner, K. H., et al. Genes Dev. 2000 14: 142-146

  7. Modificações pós-traducionais nos fatores de trancriçãoFoxo NES: Sequência de exportação nuclear NLS: sinal de localização nuclear Calnan, D.R., et al. Oncogene(2008) 27, 2276–2288

  8. Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos Calnan, D.R., et al. Oncogene(2008) 27, 2276–2288

  9. Regulação dos fatores de transcrição FoxO Calnan, D.R., et al. Oncogene(2008) 27, 2276–2288

  10. Regulação dos fatores de transcrição FoxO Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

  11. Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição • Indução de genes pró-apoptóticos • Inibição de genes relacionados ao ciclo celular • Indução da expressão de genes supressores de tumor ER: Receptor nuclear de estrógeno Calnan, D.R., et al. Oncogene(2008) 27, 2276–2288

  12. Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO Calnan, D.R., et al. Oncogene(2008) 27, 2276–2288

  13. Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase de células T por Foxo1 Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

  14. Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T (Naive) (Ativadas) Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30, 358-371

  15. Outra funções de proteínas FoxO em células T Peng, S. L. Oncogene(2008) 27, 2337-2344

  16. Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

  17. Controle molecular da diferenciação de células T reguladoras induzida por TGF-β Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

  18. OBJETIVO Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.

  19. Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- 8 semanas Histologia Expressão Foxo ELISA Score clínico A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.

  20. Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- CD4 6 a 8 semanas FACS CD8 A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4.

  21. Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- PMA+iono (4h) FACS 6 a 8 semans Isolamento CD4 (FACS) FACS Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras do tipo Th1 e Th17.

  22. Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- timo 3 semanas FACS (timo e baço) baço Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço. baço timo

  23. Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1e Foxo3? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- Cultura com FITC-VAD-FMK 3 semanas Tregs FACS FACS Camundongos com 6 semanas As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.

  24. Como é a funcionalidade das Tregsin vitro e in vivo na ausência de Foxo1e Foxo3? CD4 naive – CFSE Anti – CD3 Esplenócitos irradiados (72h) FACS WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3+/- Foxo1+/-Foxo3-/- Foxo1-/-Foxo3-/- 3 semanas Tregs FACS Tregs WT TregsFoxo1-/-Foxo3-/- (1x105) CD4 T naive (4x105 ) Rag1 -/- 6 semanas Mudança de peso Desenvolvimento de colite Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.

  25. Quais são os genes regulados por Foxo1e Foxo3? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- 189 sondas com diferença de expressão (1.5) Extração e amplificação RNA 603 sondas analisadas (genes assinatura Treg) Hibridização Affymetrix Tregs baço (FACS) 3 semanas • 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO • 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO • Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25 Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg independentemente da expressão de Foxp3. • Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular • Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17) • Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)

  26. Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos? WT Tregs (CD45.1) (3x105) V FACS (Treg e CD4) 8 semanas Foxo1-/-Foxo3-/-(CD45.2) 3-4 dias CD4 Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.

  27. Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs? 6ª 8 semanas BM WT BM Foxo1-/-Foxo3-/- (2x106) BM scurfy (2x106 ) Rag1 -/- Sobrevivência FACS Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.

  28. Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- 6ª 8 semanas 3 semanas Isolamento CD4 timo Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h (TGF-β) BM Foxo1-/-Foxo3-/- (2x106) CD45.2 BM WT (2x106 ) CD45.1 Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) Rag1 -/- FACS Tregs timo Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.

  29. Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+) Foxo1-/-Foxo3-/- 3 semanas Isolamento CD4 periferia(naive) Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β Expressão Foxp3 (FACS) Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR) Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregsinduzidas por TGF-β.

  30. Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição? rVISTA tool WT 3 semanas Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3+) Anti-Foxo1 Anti-Foxo3 Preparação cromatina Precipitação com beads de proteína A agarose Incubação com Ab anti-foxo1 e anti-foxo3 PCR do precipitado Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.

  31. Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.

  32. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? LN, baço Citometria de fluxo CD44, CD69 Linfocitos CD4+ TCRb+ Animais com 3, 8 ou15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO

  33. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN, baço Linfocitos CD4+ TCRb+ Incorporação de BrdU Linfocitos CD4+ TCRb+ PMA+Ionomicina Elisa

  34. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO HE- infiltrado celular Paralisia de membros posteriores Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T.

  35. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? Animais com 3,8 ou 15 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS

  36. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? Soro Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita.

  37. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? LN Baço Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi Citometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L Cxcr5-Tfh

  38. Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1? LN Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Linfócitos T CD4+ CD44hi do LN RT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21. A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)

  39. A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Fatores Foxo regulam 7Ilra Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69.

  40. A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f Cd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69.

  41. A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tg Cd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg LN, baço Linfócitos B B220+ Citometria de fluxo GL-7 e FAS A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de alteração homeostática).

  42. A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante? Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1 Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO após 8 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3 Tcra-/- CD45.2

  43. A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante? Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3- Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+ após 6 semanas Linfócitos T CD4+ Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3 Tcra-/- CD45.2 Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).

  44. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? Timo Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.

  45. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? LN, baço Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127 Linfócitos CD4+ TCRb+ periferia Foxp3+

  46. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg? Animais com 8 semanas foxo1f/ f- Wt Cd4Cre foxo1f/f - KO LN Linfócitos CD4+ TCRb+ Citometria de fluxo CTLA-4 Estimuladas 3 dias aCd3 aCD28 e TGFb Naive Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).

  47. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Proliferação CFSE Expressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

  48. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas Citometria : Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

  49. Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg? Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN Co- cultura células CD45.1 WT Naivestambém de LN foxo1f/ f- Wt ER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno Citometria : Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGFb,aCD3 e aCD28 Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L).

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