210 likes | 768 Views
TRANSFORMACIJA BAKTERIJA. TRANSFORMACIJA BAKTERIJA. Postupak ubacivanja plazmidne DNA u kompetentne bakterijske stanice u svrhu umnožavanja DNA sekvence od interesa ili proizvodnje pročišćenih proteina
E N D
TRANSFORMACIJA BAKTERIJA • Postupak ubacivanja plazmidne DNA u kompetentne bakterijske stanice u svrhu umnožavanja DNA sekvence od interesa ili proizvodnje pročišćenih proteina • KOMPETENTNE STANICE- bakterijske stanice smrznute u logaritamskoj fazi rasta u puferu koji sadrži Ca2+ ione • SELEKCIJA transformiranih klonova bakterijskih stanica ostvaruje se rezistencijom na određeni antibiotik sadržan na plazmidu
PLAZMIDNI VEKTORI • Kružne dvolančane molekule DNA koje se mogu replicirati neovisno o genomskoj DNA bakterije • Sadrže gene za rezistenciju na antibiotike, bakterijske toksine (bakteriocini), zaštitu od teških metala, fertilnost
VRSTE PLAZMIDA Ovisno o njihovoj funkciji: • F-plazmidi: osiguravaju bakterijsku fertilnost tj. mogućnost bakterijske konjugacije • R-plazmidi: sadrže gene za rezistenciju na antibiotike (ampicilin, kanamicin, tertraciklin, higromicin) • Col-plazmidi: nose gene za bakteriocine ( proteine koji su toksični za druge bakterije) • Degradativniplazmidi: omogućavaju razgradnju supstanci poput toluena, salicilne kiseline • Virulencijskiplazmidi: odgovorni za patogenost bakterija (hemolizin)
VRSTE PLAZMIDA Ovisno o broju kopija: NISKO KOPIJSKI (“low-copy”, “stringent”): <100 kopija/stanici; njihovu replikaciju i segregaciju kontrolira bakterijski kromosom VISOKO KOPIJSKI (“high-copy”, “relaxed”): > 100 kopija/stanici; manji plazmidi koji se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu
VRSTE PLAZMIDA Ovisno o domaćinu: • PROKARIOTSKI: umnažaju se i izražavaju u prokariotskim stanicama • EUKARIOTSKI: umnažaju se u prokariotima ili kvascima, a izražavaju u eukariotskim stanicama (komercijalni plazmidi za genetičko inženjerstvo) Razlikuju se u promotorskoj sekvenci
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Jedan od prvih komercijalnih vektora • Sadrži nekoliko restikcijskih mjesta za kloniranje (BamHI, EcoRV, ..) • Gen za rezistenciju za ampicilin(amp), tetraciklin (tet) zainsercijsku selekciju • Ori (originofreplication) je izvorište replikacije
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Sadrži višestruko mjesto za klonirnje (MCS), ori, gen za rezistenciju na Amp • Ugradnja inserta u MCS unutar lacZoperonaspriječavaα-komplementaciju gena za enzim β-galaktozidazu . Kolonije s insertom su bijele boje
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Plazmidi za ekspresiju u eukariotskim stanicama • Sadrže eukariotskupromotorsku sekvencu! • Sadrže dodatnu TAG sekvencu za vizualizaciju u stanicama (GFP, mCherry, myc, HA, Flag)
PLAZMIDI U GENETIČKOM INŽENJERSTVU • Plazmidni vektor za proizvodnju i pročišćavanje proteina • Sustav glutathione-S-transferaze (GST tag)
AFINITETNA KROMATOGRAFIJA GST-rekombinantnih proteina • Metoda razdvajanja i pročišćavanja proteina utemeljena na biološkoj interakciji analita i liganda • GST-rekombinantni protein se veze na glutation imobiliziran u koloni za pročišćavanje