Genómica de las infecciones por Citomegalovirus

Genómica de las infecciones por Citomegalovirus PROPUESTA DE TESIS DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMÉDICAS BÁSICAS DIRECTOR DE TESIS Dr. Christian A. García Sepúlveda ASESORES INTERNOS Dr. Daniel E. Noyola Cherpitel Dr. Roberto González Amaro Dr. Flavio Martínez Morales MC Diana Lorena Alvarado Hernández Laboratorio de Biología Molecular 1

Incidencia de infección 1-2%/año: población abierta (donadores de sangre). Prevalencia: 60-90%2 Causa más importante de infección congenita y el responsable de importantes secuelas neurológicas y auditivas1. Tasa de infección mayor en países en vías de desarrollo (madres solteras, no-caucásicas, bajos recursos, madres jóvenes). Incidencia de reactivación post-trasplante: 75% y pacientes con VIH/SIDA1 EPIDEMIOLOGÍA 1Ho M. The History of cytomegalovirus and its diseases. Med. Microbiol Immunol. 2008 2 http://en.wikipedia.org/wiki/Cytomegalovirus

InfecciÓncongÉnitaPOR CMV 1Ho M. The History of cytomegalovirus and its diseases. Med. Microbiol Immunol. 2008 2Boppana S. Infectious Disease: Congenital and Perinatal Infections: A concise Guide to Diagnosis. Cytomegalovirus. Chapter 6. Humana Press Alrededor del 1% de recién nacidos se infectan congénitamente por hCMV1,2 Solo entre 1 y 10% son sintomáticos1 Directamente proporcional a la prevalencia materna2 Manifestaciones clínicas: petequias, hepatoesplenomegalia, ictericia, calcificaciones intracerebrales1 Secuelas neurológicas, auditivas, visuales

InfecciÓncongÉnitaPOR CMV Infección por hCMV en el Embarazo Infección Primaria Reactivación 30-40% niños infectados 0.2 - 1% niños infectados 85-90% asintomáticos 0-1% sintomáticos 99% asintomáticos 10-15% sintomáticos 5-10% secuelas 90% secuelas 10-15% secuelas 20-30% muertes http://www.paho.org/spanish/ad/fch/ca/si-desarrollo1.htm

CMV en inmunocomprometidos • Pacientes trasplantados • 75% seropositividad después de trasplante • La morbilidad depende del tipo de órgano trasplantado • Neumonía es la complicación más común • Trasplante de médula ósea, corazón, pulmón. • VIH • Infección oportunista • Infecciones más severas conocidas • Daño a Sistema Nervioso Central • Retinitis : pérdida de la vista

VIROLOGÍA • b-herpesviridae, genoma dsDNA grande, replicación lenta. • Virión esférico envuelto 150-200 nm. • Envoltorio • Tegumento • Cápside icosaédrica 115-130 nm (T=16). • Herpesvirus mas grande reconocido en humanos.

GENÓMICA VIRAL TRL UL IRL IRS US TRS T A 235 kbp • 235 kbp • 2 dominios: L y S • Regiones únicas en cada dominio • Regiones repetitivas: T e I • Bases terminales complementarias • >200 ORFs • Mayoría de los ORFs dedicados a inmunoevasión

GENÓMICA VIRAL L T TRL UL IRL IRS US TRS A • 235 kbp • 2 dominios: L y S • Regiones únicas en cada dominio • Regiones repetitivas: T e I • Bases terminales complementarias • >200 ORFs • Mayoría de los ORFs dedicados a inmunoevasión

GENÓMICA VIRAL S T TRL UL IRL IRS US TRS A • 235 kbp • 2 dominios: L y S • Regiones únicas en cada dominio • Regiones repetitivas: T e I • Bases terminales complementarias • >200 ORFs • Mayoría de los ORFs dedicados a inmunoevasión

GENÓMICA VIRAL T TRL UL IRL IRS US TRS A • 235 kbp • 2 dominios: L y S • Regiones únicas en cada dominio • Regiones repetitivas: T e I • Bases terminales complementarias • >200 ORFs • Mayoría de los ORFs dedicados a inmunoevasión

INMUNIDAD Y COEVOLUCION Importante participación del Sistema Inmune Adaptativo. Sistema Inmune Innato cada vez cobra mayor importancia. Defectos severos del Sistema Inmune Adaptativo no necesariamente asociados a incremento de frecuencia de infecciones por CMV (SIDA=44%).

INMUNIDAD Y COEVOLUCION El sistema inmune adaptativo solamente entra en juego cuando el sistema inmune innato ha fracasado en su intento por frenar la incursión del patógeno

CÉLULAS NK Las células Asesinas Naturales (NK) son linfocitos citotoxicos del sistema inmune innato más grandes que los linfocitos B o T. No rearreglan receptores antígeno-específicos como los linfocitos B (inmunoglobulinas) y Linfocitos T (TCR). Expresan CD56, pero no CD3. Se derivan de la médula ósea y constituyen aproximadamente el 10% de los linfocitos circulantes (aprox 64 células NK/mL). Inicialmente descubiertas por su capacidad para matar a células tumorales SIN SENSIBILIZACION PREVIA. Tienen dos funciones efectoras principales: Citotoxicidad celular Secreción de citocinas

RECEPTORES DE NKs Expresan tres tipos de receptores: Receptores Inmunoglobulina-símiles (KIR) Receptores tipo lectina (CTLD) Receptores de Citotoxicidad Natural (NCR)

RECEPTORES DE NKs KIRs: Reconocen a moléculas de HLA Dicotomía funcional (activadores e inhibidores) Sistema complejo, multigénico y polimórfico

RELEVANCIA FUNCIONAL Balance de señales. Funciones inmunes: 1.- Vigilancia y participación en respuestas anti-tumorales. 2.- Participar en reacciones contra patógenos. 3.- Influir sobre la biología de la implantación.

RECEPTORES KIR Proteinas transmembrana tipo I de 2 o 3 dominios extracelulares (reconocen HLA). Colas intracitoplásmicas cortas (activadoras) o largas (inhibidoras). Colas intracitoplásmicas poseen ITIMS o ITAMS.

GENÓMICA KIR Codificados en 19q13.4 en el Complejo de Receptores Leucocitarios (LRC). Región KIR abarca 150 kb. MULTIGENICO: 15 genes KIR y 2 pseudogenes cada gen alrededor de 14 Kb. POLIMORFICO: 335 alelos KIR reconocidos. COMPLEJO: Variabilidad en numero de genes activadores (Haplotipos A y B).

GENÓMICA KIR ◀ Centrómero Telómero ▶ A B

PROPUESTA Estudiar el impacto y la relevancia clínica de las características genómicas humanas (KIR) y de la genómica viral sobre la incidencia de infecciones por CMV, su reactivación, incidencia y curso clínico.

JUSTIFICACIÓN CMV ha demostrado ser un patógeno viral importante por su incidencia y prevalencia. Cerca del 90% de los seres humanos han sido infectados Causa más importante de infecciones congénitas en humanos Importantes secuelas neurológicas. Agente causal de importante comorbilidad en pacientes inmunocomprometidos. Postrasplantados y pacientes con VIH/SIDA.

HIPÓTESIS La presencia de algunos genes KIR y características genómicas virales determinan la frecuencia de infección, reactivación viral y el curso clínico de las infecciones por CMV.

OBJETIVO GENERAL Estudiar la relevancia clínica de la diversidad genética de los receptores KIR y de la genómica de CMV en el contexto de infecciones congénitas y en pacientes con VIH/SIDA. 1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas. 2.- Evaluar la incidencia de la infección congénita por CMV en recién nacidos. 3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas. METAS Caracterizar la diversidad de genes KIR en una población abierta de Mexicanos mestizos (CGM Abierta, n=300) para servir de referencia. Caracterizar la diversidad de genes KIR presente en madres de recién nacidos infectados o no por CMV (n=200 piloto inicial). Determinar la tasa de prevalencia de infección activa e infecciones previas por CMV en mujeres embarazadas (PCR y serologia). Determinar la existencia de asociaciones genómicas KIR y virales que actúen como factores de susceptibilidad/protección a infecciones maternas por CMV.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la reactivación de la infección por CMV en mujeres embarazadas. ACTIVIDADES Optimizar de técnica genotipificación KIR por PCR-SSP. Optimizar técnica de detección de CMV en sangre para incluir ctrl interno. Optimizar técnica de evaluación serológica de anticuerpos contra CMV. Desarrollar y optimizar técnica de detección de polimorfismos virales de interés por medio de PCR-SSP. Recopilar información clínica y demográfica, así como desarrollar base de datos para el seguimiento clínico de la cohorte de mujeres embarazadas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS • 2.- Evaluar la incidencia de la infección congénita por CMV en recién nacidos. • METAS • Determinar la tasa de prevalencia de infecciones congñenitas por CMV en recién nacidos a partir de las tarjeta de Guthrie tomadas para el tamiz neonatal. • ACTIVIDADES • Evaluación y optimización de técnica de extracción de DNA genómico humano y viral a partir de tarjetas Guthrie. • Optimizar técnica de detección de CMV en tarjetas Guthrie de tamiz neonatal por PCR anidada. • Determinar la tasa de incidencia de infección congénita por CMV en recién nacidos a través del tamizaje de tarjetas Guthrie de tamiz neonatal (n=1500).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico. METAS Determinar la tasa de incidencia de la infección activa por CMV en pacientes con VIH (n=300). Determinar la existencia de asociaciones genómicas KIR y virales que actúen como factores de susceptibilidad/protección a infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA. Determinar la manera en que la diversidad genómica KIR modifica el curso clínico de las infecciones por CMV (duración y evolución) en pacientes con VIH/SIDA. Determinar la manera en que las propiedades genómicas virales modifican el curso clínico de las infecciones por CMV (duración y evolución) en pacientes con VIH/SIDA.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3.- Evaluar impacto de diversidad genómica KIR y de CMV sobre la incidencia de la infección por CMV en pacientes con VIH y su curso clínico. ACTIVIDADES Tamizar Colección Genómica de VIH para detección de CMV por PCR anidada. Caracterizar polimorfismos virales de interés (CMV) presentes en pacientes de la Colección Genómica de VIH. Desarrollo de hoja de seguimiento clínico y base de datos para cohorte de pacientes con VIH . Seguimiento trimestral de incidencia de infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA. Seguimiento clínico del curso de las infecciones por CMV en pacientes con VIH/SIDA.

Análisis • Análisis de resultados • Inferencia de haplotipos y genotipos KIR para las cohortes de estudio y pacientes sometidos a caracterización KIR en base a contenido de genes. • Evaluación de asociaciones genéticas (humanas y virales) y parámetros clínicos como tasa de incidencia de infecciones activas por CMV en madres, tasa de incidencia de infecciones por CMV entre neonatos, tasa de infección por CMV en pacientes con VIH así como curso de la enfermedades en esta última cohorte basada en el paquete estadístico SPSS V14 para Mac OSX empleando pruebas estadísticas correspondientes. • Chi cuadrada y Fisher’s exact para análisis de parámetros genéticos (contenido de genes KIR, haplotipos, genotipos virales, etc). • Curvas de sobrevivencia de Kaplan-Maier con regresión logística para análisis del impacto de parámetros temporales (tiempo de duración de infección por CMV, tiempo a la muerte, tiempo libre de enfermedad, etc).

Gracias

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