Metody badań toksyczności substancji chemicznych

1. Metody badań toksyczności substancji chemicznych Ustalanie ADI, badania epidemiologiczne

2. Toksykologia żywności Przedmiotem badań i oceny toksykologicznej są: • substancje naturalnie występujące w żywności • substancje stanowiące zanieczyszczenia żywności • substancje lub ich mieszaniny dodawane do żywności w określonym celu (dodatki do żywności)

3. Badania toksykologiczne • Dotyczą zazwyczaj działania określonego związku, rzadziej mieszaniny substancji znanych i bardzo rzadko mieszaniny o nieznanym składzie • Badania wykonuje się na kilku gatunkach zwierząt

4. Zwierzęta doświadczalne Są to najczęściej: • Myszy białe • Szczury białe • Chomiki • Świnki morskie • Króliki • Psy Do oceny działania mutagennego • Używa siębakterii i drożdży

5. Badania toksykologiczne- znaczenie paszy • Dieta syntetyczna o stałym składzie • Dieta półsyntetyczna – składająca się tylko częściowo z czystych związków chemicznych (węglowodany, aminokwasy, witaminy, składniki mineralne) oraz z oczyszczonych składników naturalnych (skrobia, cukier, kazeina)

6. Podawanie paszy i wody • Najczęściej stosuje się podawanie paszy i wody ad libitum z jednoczesną kontrolą spożycia • Substancje badane podaje się w paszy, zgłębnikiem dożołądkowo (rzadko) lub w wodzie do picia • Przy badaniu wpływu metali na organizm woda powinna być dejonizowana

7. Badaniom powinny podlegać • Związki pochodzenia naturalnego lub ich mieszaniny • Związki otrzymane na drodze syntezy chemicznej lub ich mieszaniny • Związki lub ich mieszaniny otrzymane na drodze syntezy biologicznej, np. preparaty enzymatyczne • Nowe środki spożywcze lub preparaty, np. białkowe, tłuszczowe, ich substytuty dodawane do żywności

8. Zakres badań toksykologicznych • Toksyczność ostra, podostra i przewlekła • Działanie rakotwórcze • Działanie mutagenne • Działanie teratogenne i embriotoksyczne • Wpływ na płodność i rozrodczość • Metabolizm • Synergizm i antagonizm • Działanie drażniące oka i skóry • Działanie alergiczne

9. Zasady badań toksykologicznych • Do doświadczeń używa się zwierząt zdrowych, znanego szczepu i ze znanej hodowli; są to zwierzęta obu płci, młode, karmione bez ograniczeń paszą pełnowartościową zapewniającą prawidłowy wzrost i rozmnażanie

10. Toksyczność ostra • To działanietoksyczne wywołane podaniem badanej substancji w dawce pojedynczej lub w kilku dawkach w ciągu 24 h • Jej jednostką jest medialna DL50 wyrażona w mg/kg m. c. zwierzęcia

11. Toksyczność ostra • Jej badanie przeprowadza się przynajmniej na 3 gatunkach zwierząt, młodych, o zbliżonej masie ciała np. szczury ok. 200g • Substancję podaje się per os w kilku różnych dawkach, obserwuje się zwierzęta przez określony czas (co najmniej 14 dni) i liczy zwierzęta, które padły w każdej grupie

12. Toksyczność ostra • Obserwacje powinny obejmować: początek wystąpienia, charakter i czas trwania objawów toksycznych • Powinny dotyczyć: ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, oddechowego, sercowo-naczyniowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, wyglądu skóry, błon śluzowych i oczu

13. Toksyczność ostra • Kilka dni przed podaniem badanej substancji i do czasu zakończenia obserwacji kontroluje się masę ciała początkową i końcową oraz spożycie paszy • Wykonuje się sekcję zwierząt padłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia oraz badania makro- i mikroskopowe narządów

14. Toksyczność podprzewlekła • Jej badanie wykonuje się na 2 gatunkach zwierząt (1 to najczęściej szczury, a drugi nie powinien być gryzoniem) • Czas trwania doświadczenia wynosi zwykle ok. 1/10 normalnego okresu życia zwierząt (szczury, myszy – 90 dni, świnie – 1 rok) • Używa się młodych zwierząt (np. szczury 4-5 tyg. o masie ok. 50-60 g)

15. Toksyczność podprzewlekła • Badaną substancję podaje się w paszy w 3-4 różnych dawkach • Dawki powinny być tak dobrane aby jedna stanowiła poziom NOAEL a druga LOAEL • Wielkość dawek ustala się w badaniach pilotażowych trwających ok. 4 tyg.

16. Toksyczność podprzewlekła Zakres badań obejmuje Badania ogólne: • wygląd i ogólny stan zdrowia, zachowanie zwierząt • śmiertelność (ustalenie przyczyn) • codzienne spożycie paszy i wody • przyrost masy ciała

17. Toksyczność podprzewlekła Badania hematologiczne: • hematokryt • zawartość hemoglobiny • liczba krwinek czerwonych, białych i płytek krwi • czas protrombinowy

18. Toksyczność podprzewlekła Badania biochemiczne: • W surowicy: m.in. białko, glukozę, azot mocznikowy, TG, cholesterol, elektrolity, enzymy- ALAT, ASPAT, AP • W wątrobie: białko, enzymy- ALAT, ASPAT, AP i wiele innych Badanie moczu oraz badania hematologiczne i biochemiczne wykonuje się po 2, 4 i 12 tyg. równolegle w grupach badanych i kontrolnych

19. Toksyczność podprzewlekła • Badanie oczu – na początku i na końcu • Sekcja zwierzątpadłych i uśpionych po zakończeniu doświadczenia –należy zważyć wszystkie narządy i wykonać • Badanie histopatologiczne – co najmniej 20-22 narządów i tkanek

20. Toksyczność przewlekła • Dobór zwierząt jak w toksyczności podostrej • Czas trwania doświadczenia – praktycznie cały okres życia zwierząt, np. dla szczurów – ok. 2 lata, myszy – 1,5 roku, świń – 5-7 lat

21. Toksyczność przewlekła • Substancję badaną podaje się w paszyw różnych dawkach ustalonych wcześniej w badaniach toksyczności podprzewlekłej, tak aby można było wyznaczyć poziomy: • NOAEL i LOAEL

22. Toksyczność przewlekła • Obserwacjezwierząt, badania krwi, wątroby i moczu – tak jak w badaniu toksyczności podostrej • po 6, 12, 18 i 24 miesiącach (dla gryzoni) • Badania histopatologiczne – w zależności od wyników badań toksyczności podostrej mogą być poszerzone o inne narządy (aortę, oko, język, grasicę, ślinianki i inne)

23. Badanie rakotwórczości • Zwierzęta: myszy i szczury młode, jak w teście podprzewlekłym, pochodzące od rodziców otrzymujących przez ok. 2 miesiące przed kojarzeniem paszę z dodatkiem badanej substancji w odpowiednich dawkach

24. Badanie rakotwórczości Grupy zwierząt: • Kontrolna • Otrzymująca dawkę maksymalną – • Otrzymująca 1/3 dawki maksymalnej • Otrzymująca 1/9 dawki maksymalnej

25. Badanie rakotwórczości Liczba zwierząt • 100 szczurów (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki • 100 myszy (po 50 każdej płci) dla każdego poziomu dawki Czas podawania substancji w paszy • Szczury – 2 lata • Myszy – 1,5 roku • Psy, świnie – 5-7 lat

26. Badanie rakotwórczości Obserwacje: • Spożycie paszy, wody i masa ciała – jak w toksyczności przewlekłej • Stan zwierząt – każdego dnia, dzień śmierci zwierząt padłych i jej przyczynę na podstawie sekcji • Na końcu – sekcja pozostałych zwierząt i badania makroskopowe, waży się: wątrobę, nerki, śledzionę, nadnercza, węzły chłonne, tarczycę, jajniki, mózg, przysadkę, jądra, płuca, pęcherz

27. Badanie rakotwórczości • Wykonuje się rozmaz krwi i szpiku • Badana mikroskopowe 7 pierwszych narządów ale bada się także te narządy, w których obserwowano zmiany w czasie sekcji

28. Badanie rakotwórczości Interpretacja: • Oparta jest na liczbie się guzów i czasie ich pojawienia się w tych samych narządach zwierząt badanych i kontrolnych oraz czasie przeżycia zwierząt • Uwzględnia się guzy złośliwe i niezłośliwe

29. Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo • Ma na celu zbadanie możliwego wpływu badanej substancji na płodność i laktację oraz pozwala na zaobserwowanie zmian genetycznych • Grupy zwierząt i dawki – jak przy toksyczności przewlekłej

30. Badanie zdolności rozrodczej i wpływu na potomstwo Obserwacje: • % zapłodnienia • Okres ciąży (krótszy, dłuższy) • Liczba młodych w każdym miocie • Masa ciała młodych • Śmiertelność noworodków • Odchylenia od stanu prawidłowego w 4, 12 i 21 dniu życia • Badania histopatologiczne narządów od 10 samic i 10 samców z każdej grupy

31. Badanie teratogenności Zwierzęta: • Szczury, chomiki, króliki (zalecane samice po raz pierwszy zapładniane), po 20 zwierząt dla każdej dawki • Młode, zdrowe, dojrzałe fizycznie i płciowo • Badaną substancję podaje się w paszy ciężarnym samicom w okresie organogenezy (szczury – 6-15 dzień ciąży, chomiki – 6-10 dzień, króliki dzień- 6-18)

32. Badanie teratogenności • Dawkowanie substancji zależy od szybkości jej wydalania z organizmu oraz jej działania embrio- i cytotoksycznego

33. Badanie teratogenności Wymagane są co najmniej 3 poziomy dawek, np. • Grupa kontrolna • Grupa otrzymująca dawkę małą – 1/250 DL50 • Grupa otrzymująca dawkę pośrednią – 1/100 DL50 • Grupa otrzymująca dawkę dużą – 1/50 DL50

34. Badanie teratogenności Obserwacje: • Spożycie paszy i wody oraz kontrola masy ciała w określonych dla danego zwierzęcia dniach ciąży • Płody wyjmuje się przez cesarskie cięcie u szczurów na 1 dzień przed porodem, u królików – 2 dni

35. Badanie teratogenności Ocenia się: • Liczbę płodów po prawej i lewej stronie macicy • Liczbęresorpcji • Liczbę ciałek żółtych • Masę płodów z łożyskiem i bez • Długość płodu z ogonem, długość ogona • Płeć • Deformacje makroskopowe • Deformacje szkieletu • Liczbę krwiaków

36. Badanie teratogenności • U 20% samic w grupie nie wykonuje się cesarskiego cięcia • Płody normalnie urodzone obserwuje się przez 2-3 miesiące aby wychwycić wady pojawiające się w czasie rozwoju • Wybrane losowo zwierzęta kojarzy się w celu otrzymania II generacji • Młode tej generacji usypia się po 21 dniach i bada ich rozwój

37. Badanie mutagenności • Działanie mutagenne jest ściśle związane z działaniem rakotwórczym • Ok. 90% związków rakotwórczych wykazuje działanie mutagenne w prostych testach bakteryjnych

38. Badanie mutagenności • Stosuje się testy bakteryjne Amesa • Pozwalają wykryć mutacje punktowe: • mikrojąderkowy – umożliwia wykrycie uszkodzeń w chromosomach • test reperacji DNA

39. Badanie działania alergicznego- kontaktowego • Testy na zwierzętach • Badania z udziałem ludzi – testy w klinikach dermatologicznych Dotyczą kosmetyków i środków piorących

40. Ekstrapolacja wyników badań • Biorąc pod uwagę wyniki wszystkich badań na zwierzętach oraz ustaloną w badaniach toksyczności przewlekłej dawkę NOAEL – ustala się dawkę ADI dla człowieka ADI = NOAEL : 100 (najczęściej ale może to być także :10 lub :1000)

41. Badania epidemiologiczne Kiedy wiadomo, że zanieczyszczenie wnikające do organizmu ma potencjalne właściwości rakotwórcze jest możliwe: Retrospektywne badanie epidemiologiczne jeżeli wykaże ono zależność między ekspozycją na czynnik rakotwórczy i zachorowalnością oraz śmiertelnością – czynnik może zostać uznany za rakotwórczy dla ludzi