Biochemie v letním semestru - MODUL A -

1. Biochemie v letním semestru- MODUL A - Zápočet • 4 praktika (A1 – A4) • 3 ústní přezkoušení: • Dýchání, Krev a tělní tekutiny • Urogenitální systém, Acidobazická rovnováha • Trávení a vstřebávání, Intermediární metabolismus

3. Laboratorní metody- letní semestr - Vladimíra Kvasnicová

4. Preanalytická fáze = příprava a zpracování vzorků před vlastní laboratorní analýzou • náběr krve • sérum x plazma • každý biologický materiál je potenciálně infekční ! • ukázka zpracování vzorků krve v biochemické laboratoři - video

5. Centrifugace = metoda používaná k oddělení pevných složek směsi od přítomné kapalné fáze na základě jejich velikosti, tvaru a hustoty, viskozity média a rychlosti rotoru odstředivá síla:P = m x r x2 m – hmotnost částice r - poloměr centrifugy  - úhlová rychlost

6. Centrifugace • fixní úhel rotoru nebo horizontální • centrifuga musí být vyvážená Obrázek převzat zhttp://www.all-science-fair-projects.com/science_fair_projects_encyclopedia/Centrifuge a http://www.flickr.com/photos/gonzales2010/9624402/ (únor 2008)

7. Centrifugace Obrázek převzat zhttp://www.flickr.com/photos/businesscheese/1803417133/ (únor 2008)

8. Centrifugace • rychlost: počet otáček za minutu(RPM = revolutions per minute) ! Nastavením stejné hodnoty RPM v centrifugácho různém poloměru nedosáhneme stejné odstředivé síly ! • odstředivá síla:relativní odstředivé zrychlení(RCF=relative centrifugal force) • RCF = 1.12 x 10-5x r x (rpm)2 • r = poloměr centrifugy (cm) • jednotky: gRCF udává kolikrát je zrychlení centrifugy větší než je normální tíhové zrychlení g = 9.81 m x s-2

9. Centrifugace a) běžné laboratorní centrifugy (až 10 000 G) b) vysokorychlostní chlazené centrifugy (až 50 000 G) c) ultracentrifugy /chlazené + vakuum/ (až 500 000 G) příklad: k oddělení séra ze sražené krve stačí centrifugace 10 min. při RCF = 1000 g

10. Obrázek převzat zhttp://www.chem.arizona.edu/tpp/chemt/CAn/Graphics/centrifuge/blood%20centrifugation.png a http://www.academic.marist.edu/~jzmz/HematologyI/Intro3.html (únor 2008)

11. Obrázek převzat zhttp://science.tjc.edu/Course/BIOLOGY/bott/anatomy/2402/summer%202402%20%20blood%20notes/c18_02.jpg a http://faculty.washington.edu/kepeter/119/images/hematocrit_tube_trio.jpg(únor 2008)

12. A) Preparativní centrifugace • slouží k separaci částic od kapalné fáze • získáme 2 frakce: • sediment(pelleta, pevná fáze) • supernatant(kapalná fáze) Obrázek převzat zhttp://www.steve.gb.com/science/molecular_biology_methods.html (únor 2008)

13. frakční centrifugace(= diferenciální centrifugace) • zvláštní typ preparativní centrifugace • používá se k separaci buněčných organel, které se liší velikostí a hustotou • při použití nízkého RCF sedimentují jen částices velkou hustotou → vytvořený supernatant se přelije do jiné zkumavky a centrifuguje při vyšší hodnotě RCF opakováním postupu získáme frakce různých buněčných organel

14. Frakční centrifugace Obrázek převzat zhttp://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/c7x3fractionation.jpg (únor 2008)

15. B) Analytická centrifugace • používá se k měření fyzikálních vlastností sedimentujících částic(sedimentační koeficient, molekulová hmotnost) • používají se ultracentrifugy • centrifugované částice jsou během centrifugace sledovány optickým systémem(měření absorbance či zákalu) a průběh procesu je zobrazován pomocí PC

16. Elektroforéza(ELFO) = analytická metoda založená na pohybu nabitých částic vlivem vnějšího elektrického pole (stejnosměrný proud) • rychlost elektromigrace závisí na: a) velikosti, tvaru a náboji částice b) vloženém napětí

17. Elektroforéza • anion – negativně nabitý ion, pohybuje se směrem k anodě (+) • kation – pozitivně nabitý ion, pohybuje se směrem ke katodě (-) • amfolyt – látka, která může mít pozitivní, negativní či nulový celkový náboj, a tov závislosti na vnějších podmínkách (pH)např. proteiny

18. Klasifikace elektroforetických technik • volná elektroforéza • separace probíhá pouze v kapalné fázi(v pufru), tj. bez účasti nosného média (kapilární elektroforéza) • elektroforéza na nosičích • papír, gel (agaróza, polyakrylamid) • horizontální nebo vertikální uspořádání

19. Kapilární elektroforéza Obrázek převzat zhttp://www.hood.edu/images/content/academics/instruments/Agilent_Capillary_Electrophoresis_System.JPG(únor 2008)

20. Kapilární elektroforéza Obrázek převzat zhttp://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis (únor 2008)

21. Gelová elektroforéza- horizontální uspořádání Obrázek převzat zhttp://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4.jpg (únor 2008)

22. Gelová elektroforéza – vertikální uspořádání SDS-PAGE – animace Obrázek převzat zhttp://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/page.jpg (únor 2008)

23. Parametry ovlivňující elektroforetickou separaci • pH mění náboj analytu (disociace) a tím i jeho pohyblivost; může měnit i strukturu analytu (denaturace) • iontová síla mění napětí či proud: zvýšení iontové síly obvykle sníží migrační rychlost a způsobí zahřívání systému • teplota: vysoká teplota může denaturovat (vysrážet) proteiny; nízká teplota snižuje difuzi, ale také migrační rychlost, nemá vliv na rozlišení • proud: příliš vysoký proud způsobí přehřátí systému • napětí: migrační rychlost je přímo úměrná napětí • čas: rozlišení (vzájemné oddělení proužků) roste lineárněs časem, ale rozmytí proužků (difuze) roste se čtvercem času • nosné médium: velikost pórů nosiče a endoosmóza ovlivňují migrační rychlost (výběr typu nosiče)

24. Průběh elektroforézy • aplikace vzorku • nastavení vhodného napětí nebo proudu! STEJNOSMĚRNÝ PROUD !(gelová elektroforéza: kolem 70 - 100 V,kapilární elektroforéza: kolem 20 000 V) • nastavení doby separace: řádově minuty(př. gelová elfo proteinů séra trvá asi 30 min.) • při elfo na nosičích následuje po separacifixace a barvení • vyhodnocení: • kvalitativní (srovnání se standardy) • kvantitativní (na nosičích: densitometricky)

25. Vybavení pro gelovou elektroforézu používanou v praktiku A1 zdroj stejnosměrného proudu nádobky na barvení a odbarvování gelu elektroforetická komora aplikátor

26. Elektroforéza– příklady klinického využití - • separaceproteinů séra, izoenzymů,nukleových kyselin • imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/images/controlGel1.jpg (únor 2008)

27. Elektroforéza– příklady klinického využití - • separaceproteinů séra, izoenzymů,nukleových kyselin • imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z http://www.sebia.com/V2/php/index.php?tpc=1&nv=0,2&page=contenu&id_prod=39#(únor 2008)

28. Využití elektroforézy proteinůk diagnostice nemocí • rozdělení proteinů do frakcí je za fyziologických podmínekkonstantní(poloha, intenzita) • zastoupení proteinů v plazmě se při různých onemocněníchmění(vzájemný poměr) specifický vzhled elektroferogramu(rozložení frakcí nebo píků)

29. Hlavní proteiny jednotlivých frakcí imunoglobuliny: IgG, IgA, IgM 2-makroglobulin haptoglobin 1-antitrypsin orozomukoid transferin C3-komplement

30. Výsledek ELFO proteinů sérana agarózovém gelu – 6 frakcí hypergama- globulinémie normální nález Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/proteinControl.html (únor 2007)

31. Výsledek ELFO proteinů sérana agarózovém gelu – 5 frakcí • fyziologický nález • akutní onemocnění • výskyt paraproteinu • frakce fibrinogenu při analýze plazmy

32. Denzitometrický záznam elektroforézy 60% 3% 9% 12% 16% Obrázky převzaty z http://www.sebia-usa.com/products/hyrys2.htmla z http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/GENER27.HTM(únor 2007)

33. Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, 1997. ISBN 0‑471‑15451‑2

34. Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, 1997. ISBN 0‑471‑15451‑2

35. Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

36. Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

37. IMUNOFIXACE- určování typu paraproteinu (monoklonálního Ig) Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

38. Detekované paraproteiny(monoklonální protilátky /myelom ) Obrázek převzat z http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/B/Blood.html#lipids(duben 2007)