Urolitíase e hepatotoxicidade relacionados ao transportador de ânions Sat1 em camundongos

1. Bruna de Carvalho Sorrentino Tiago Henriques Moreira Fisiologia Renal 3º período – Medicina Universidade Federal do Rio de Janeiro Macaé, 25 de Julho de 2012 Urolitíase e hepatotoxicidade relacionados ao transportador de ânions Sat1 em camundongos

2. Sat1: • Transportador de ânion sulfato 1; • Também denominado Slc26a1; • Localizado na membrana basolateral dos rins e segmentos distais do intestino (íleo distal, ceco e cólon proximal); e na membrana sinusóide dos hepatócitos; • Medeia o transporte epitelial de oxalato e sulfato; • Importante papel na homeostase do oxalato e sulfato. • O gene do Sat 1 está localizado no Exon 2/ Íntron 2 do gene da alfa-L- iduronidase (IDUA).

3. Urolitíase: • O oxalato de cálcio, produto da excreção urinária, pode formar cristais que ao se agregarem podem formar cálculos renais no sistema urinário. Hepatotoxicidade: • O sulfato é essencial para a fase II da detoxificação no fígado, e é altamente reabsorvido pelos rins.

4. Objetivo principal do estudo: • Determinar as funções fisiológicas do transportador Sat1 na regulação da homeostase do oxalato e do sulfato.

5. Métodos e Resultados:

6. 1. Construção do vetor alvo: • Fragmentos de Sat 1 foram multiplicados por PCR para se criar o fragmento alvo. A estratégia utilizada para a criação do fragmento alvo consiste da troca do Exon 3 por um cassete de resistência à Neomicina.

7. 2. Criação e identificação de camundongos Sat1-/- : • O fragmento alvo é eletroporado para células embrioblásticas de camundongo; • Células embrioblásticas positivas são injetadas em blastócitos CD1, que são implantados na fêmea receptora; • Camundongos quiméricos foram cruzados com heterozigóticos, a fim de produzir camundongos Sat1-/-.

8. 3. Determinação do genótipo dos camundongos: • O fragmento do alelo recombinante de Sat 1 foi amplificado por PCR, a fim de se obter o genótipo dos camundongos; • O transportador Sat 1, nos camundongos Sat1-/-, encontra-se ausente nas vesículas da membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco, cólon proximal.

9. 4. Análise do RNA: • RNA total é separado em gel em estado tampão, e transferido para membranas de nylon. • Os borrões formados são injetados com cDNA de Sat1; • RNA total foi transcrito reversamente usando hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa virótica (Progen); • Primer P8 (exon 2) e P9 antisense (exon 4) foram usados para amplificar os fragmentos de cDNA Sat1;

10. 5. Preparação da vesícula de membrana e estudos de transporte: • Vesículas de membrana basolateral (BLMVs) e da borda em escova (BBMVs) foram isoladas do rim, fígado e intestino, e pré-incubadas em solução tampão; • A absorção de sulfato e oxalato foi medida pela técnica de filtração rápida; • Proteínas da BLMV foram separadas em gel e transferidas para a membrana de nylon; • Protéínas Sat1 foram detectadas usando anticorpos para Sat1.

11. Sat1-/- : Diminuição no transporte de oxalato e sulfato na membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal, ceco e cólon proximal.

12. 6. Análise bioquímica: • Sangue: coletado da veia submandibular; • Urina: coletada por micção espontânea prévia à coleta de sangue; • HCl foi adicionado a amostras de plasma e urina; as amostras foram congeladas para evitar a precipitação de oxalato e oxalogênese. • Os níveis de atividade do gene IDUA no rim e fígado foram avaliados; • Foram medidos os níveis de: • Sulfato; • Oxalato; • Creatinina; • PO4- , Na+ , K+ , Cl- , Ca2+ plasmáticos; • Glicolato urinário; • Proteínas na urina; • pH; • H2O cecal;

14. 7. Análise histopatológica: • Tecidos foram dissecados em ~ 50 volumes com 10% de tampão de formalina, fixados por 3 dias, e imersos em parafina; • Tecidos foram seccionados, marcados para detecção de cristais de oxalato de cálcio, e examinados por microscopia de luz; • Seções do fígado apresentaram degeneração e necrose severas.

15. Urolithiasis in Sat1–/– mice. (A and B) Representative H&E-stainedkidney sections showing infiltration of leukocytes (arrow) around therenal cortical vessels in 100% of Sat1–/– mice (n = 8), absent in Sat1+/+mice.(C–F) Representative Yasue-stained kidney (C and D) and bladder(E and F) sections showing calcium oxalate stones (dark staining)in kidney tubules of 47% Sat1–/– mice (n = 15) and bladders of26% Sat1–/– mice (n = 19), but not in any Sat1+/+ mice (n = 10). Grosshistological analyses of additional tissues in which Sat1 is expressed(liver and brain) showed no structural differences between Sat1–/– andSat1+/+ mice (not shown). Scale bars: 100 ìm (A and B); 500 ìm (Cand D); 2 mm (E and F).

16. 8. Administração de APAP: • Acetaminofeno (APAP) foi dissolvido em soro, filtrado e esterilizado; • Com ~ 3 meses, os camundongos receberam injeção de APAP, morrendo entre 2 a 12 hs após administração.

17. Necrose hepática após administração de APAP: (C and D) Representative H&E-stainedliver sections of Sat1+/+ and Sat1–/– mice (n = 6–7 per group) 12 hoursafter administration of 250 mg/kg APAP, showing liver necrosis inSat1–/– mice.

18. Nos camundongos Sat1-/- : • Não aconteceram diferenças no peso corporal, tamanho do rabo ou outra característica corporal que distinguisse camundongos Sat1-/- dos Sat1+/- ou Sat1+/+. Porém, foram observadas diferenças histológicas; • As veias corticais renais sofreram infiltração por leucócitos: sugestiva de obstrução ureteral ou uropatia obstrutiva; • Cristais de oxalato foram observados nos túbulos corticais renais e na bexiga; • Aumento da concentração plasmática do oxalato e diminuição da concentração do sulfato; • Aumento do sulfato e diminuição do oxalato no conteúdo cecal.

19. Sat1 e IDUA: • Os genes Sat1 e IDUA são sobrepostos; • Distorções seletivas no gene IDUA não levaram a alterações nos níveis de RNAm para Sat1; • Ausência de mudanças na atividade funcional do IDUA em Sat1-/- sugere que efeitos antisense não atuem de forma relevante na regulação da expressão dos genes Sat1 e IDUA.

20. Sat1-/- e oxalato: • Os níveis elevados de oxalato no plasma, • aumento da razão oxalato/creatinina na urina, • manutenção da razão glicolato/creatinina na urina (indicador da produção hepática de oxalato), • e redução no transporte de oxalato na membrana basolateral de segmentos do intestino distal: SUGEREM QUE >

21. Hiperoxalúria e hiperoxalemia: • A hiperoxalúria nos camundongos Sat1-/- é devido à hiperoxalemia, e não a alterações do oxalato nos túbulos renais.

22. Sat1-/- e sulfato: • Diminuição significante do sulfato no soro, • aumento da razão sulfato/creatinina na urina, • e aumento no índice de excreção fracionada (FEI) de sulfato: SUGEREM QUE >

23. Hiposulfatemia: • Ocorre provavelmente devido à elevada excreção renal de sulfato em camundongos Sat1-/-. • Há grande redução do transporte de sulfato através da membrana basolateral renal e sinusoidal hepática, • sugerindo que Sat1 é o transportador de sulfato predominante na membrana basolateral do túbulo proximal renal, e na membrana sinusoidal dos hepatócitos.

24. Sat1-/- e a hepatotoxicidade: • O esgotamento de sulfato pela ausência de Sat1 nas membranas sinusoidais dos hepatócitos, onde facilitam o importe de sulfato para as reações de sulfonação, e a hiposulfatemia, acarretam em lesões hepáticas induzidas por fármacos como o APAP.

25. Referência bibliográfica: Dawson PA, Russell CS, Lee S, McLeay SC, Van Dongen JM, Cowley DM, Clarke LA, Markovich D. Urolithiasis and hepatotoxicity are linked to the anion transporter Sat1 in mice. J Clinical Investigation. 2010; 120 (3):706-712.