4-5. gyakorlat

1. Az Enterococcusok, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa és Clostridiumok, Listeria monocytogenes és a Campylobacter jejunikimutatása 4-5. gyakorlat

2. Enterococcus spp. Streptococcaceae család, Streptococcus nemzetség, Lancefield D szerológiai csoport • Enterococcus faecalis (var. liquefaciens, var. zymogenes) • Enterococcus faecium • Enterococcus durans

3. Gram + 2-6 tagú láncok 0,5-1 μm kissé megnyúltak általában nem mozognak, de ritkán előfordul mozgó törzs is Anaerob aerotoleráns (tejsavas erjedés) Általános jellemzők

4. Általános jellemzők Indikátor mikrobák (fekál kontamináció). Termorezisztencia (pasztőrözési eljárások hatékonyságát, lehet vele ellenőrizni) A nem-spórások közül a legellenállóbbak (nem megfelelő fertőtlenítés ellenőrzése), Ételmérgezés (106) α- vagy β-haemolysis véres agaron

5. „Sherman kritériumok” • Képesek fejlődni 10 – 45°C között • Túlélik a 60°C-os 30 perces hőkezelést • Fejlődnek 6,5%-os sókoncentráció mellett • pH 9,6 • 0,1 % metilénkéket tartalmazó tejben • 40% epét tartalmazó véres agaron jól fejlődnek

6. Szilárd táptalajok Na-azidos agar Na-azidos véres agar (Packer-agar, defibrinált steril vér, vizes-kristályibolya, vizes Na-azid) TTC agar (trifenil-tetrazolium-klorid) (Slanetz-Bartley agar) A Na-azid gátolja a Gram-negatív flórát; az Enterococcusok a TTC-t redukálják vörös formazánná → telepek vörösesbarna színűek

7. Folyékony tápközegek Na-azidos tápleves Raj-szerint (Na-azid, brómtimolkék) Litsky-Mallman- féle Na-azidot tartalmazó dúsító táptalaj (Na-azid, etilibolya)

8. Biokémiai azonosítás • Gram festés: + • Kataláz-próba: - kataláz enzim 2 H2O2 2 H2O + O2 húsleves tenyészet + 3%-os H2O2 • Hőtűrő-képesség vizsgálata: húsleves tenyészet (37°C, 48 óra) → 60°C, 30 perc vízfürdő → alapos felrázás → oltókacsnyi mennyiséget másik levesbe átoltani → 37°C, 48 órás inkubáció → ha zavaros és kataláz negatív → +

9. Enterococcusok kimutatása vízből(201/2001.(X.25.)Korm.r.,65/2004.(IV.27.)FVM-ESZCSM-GKM) Membránszűréses módszer: 100, vagy 250 ml víz szűrése 0,45 µm pórusméretű membránon Tenyésztés Slanetz-Bartley táptalajon, 37 oC, 48 óra Enterococcus telepek vöröses-barna színűek

10. S. aureus általános tulajdonságai • Gram +, fak. anaerob, 0,8-1μm, legkisebb coccus, típusosan szőlőfürt elrendeződésű, • Nem mozog • Aranysárga pigmentet termel • Sótűrő: 7,5%-os sótartalmú talajon is szaporodik • 6-47°C is szaporodik • pH 4,3-8,0 között is szaporodik • 20-45°C-on toxint termel

11. S. aureus általános tulajdonságai • Szaporodás aw>0,86 • Toxintermelés aw>0,92 • NO3→ NO2 • Bontja: glükóz (aerob és anaerob), laktóz, szacharóz, maltóz, mannit • Mannitot aerob és anaerob módon is bontja (Differenciálás Micrococcustól, S. epidermidis-től: ezek csak aerob viszonyok között bontják a mannitot) • Haemolizál: α, β, γ, δ haemolysint termel

12. A S. aureus előfordulása • A leggyakoribb gennykeltő baktérium, nyálkahártyán normális esetben is lehet. Az emberek és az állatok az elsődleges hordozói. Jelen vannak az orrüregben és a garatban, valamint egészséges egyéneknél a hajon és a bőrfelületen is. • Nátha esetén számuk megnő, az élelmiszerek könnyen kontaminálódhatnak. • Azért nem okoz túl nagy problémát, mivel borzasztó táp- és vitaminigényes, rossz versengő mikroba. • Tésztagyártás→elszaporodik, jól tűri a beszárítást • Mastitis

13. A S. aureus előfordulása • Hús és hústermékek • Baromfi és tojás • Tojás-, tonhal-, csirke-, burgonya- és tésztasaláta • Sütőipari termékek, krémmel töltött tészták • Krémes sütemények • Szendvicstöltelékek • Gomba • Tej és tejipari termékek

14. A S. aureus által kiváltott ételmérgezés • Entero- és neurotoxikus hatású, tünetek 30 perc (!) alatt kialakulnak. • Enterotoxin: A, B, C, D, E, F hőálló polypeptid (diszulfid hidak), 121,1°C-on 20 perc alatt bomlik. • Nem minden törzs termel enterotoxint (kb. 50%) • Infektív dózis: <1.0 μgtoxin az élelmiszerben • 105/g szükséges, de a szám nem ad megfelelő felvilágosítást • Az enterotoxin-termelés és koaguláz-pozitivitás között nincs egyértelmű korreláció (is-is)

15. Táplevesek • Jelenléti/hiánypróba, MPN • Giolitti-Cantoni-féle (Micrococcus szaporodása gátolt) • Mannit: elektív előny a S. aureusnak, • LiCl: Gram-neg.-t gátol, • Tellurit: Gram-poz.-t gátol, K-telluritot redukálja→fém tellúr→fekete csapadék

16. Szilárd táptalajok Baird-Parker-agar, 37°C, 24-48 óra • Összetétel: ua. mint leves + tojássárgája emulzió • tellurit → fémes tellúr – fekete • feltisztulás: lecitináz • opálos zóna: lipolízis, proteolízis • Telep: • 24 órás tenyészet: gombostűfej, koromfekete, sima szélű és felületű, keskeny átlátszó széllel, feltisztult udvar • 48 órás tenyészet: kölesnyi, feltisztult udvar 3-5 mm, ezen belül 2 mm opálos zóna

17. Biokémiai azonosítás 1. Gram + 2. Koaguláz próba: a.) Tárgylemez próba (tájékozódó vizsgálat!): 1 csepp víz + telep (vagy 1 csepp agy-szív inf. leves) +1 csepp 37°C nyúlvérplazma →5 sec múlva csapadékképződés b.) Kémcső próba: agy-szív levesbe: 37°C, 20-24h ↓ 0,1 ml + 0,3 ml nyúl vagy emberi vérplazma (ill. 0,9 ml teljes citrátos házinyúl vér) ↓ 37°C, 2-4-6 óra ↓ Pozitív: alvadás ++,+++,++++ S. aureus: 99% pozitív; S. hyicus, S. delphi néha + Negatív: nincs alvadás: S. epidermidis

18. Biokémiai azonosítás 3. Termostabil Dezoxi-ribonukleáz próba S. aureusnak hőálló DNS-bontó enzimje van DNS-agar (toluidin kék metakromásan fest) Agy-szív leves → 15 perc forró vízfürdőbe → majd az agarba vájt 15-20 μl űrtartalmú lyukakba mérünk a hőkezelt tenyészetből → 37°C, 4 órás inkubáció után vizsgáljuk lemezt: +: lyuk körül 1 mm széles rózsaszínű gyűrű (kék → rózsaszín), 0,005 μg/ml esetén (nyomnyi) a reakció már pozitív+, magából a hőkezelt élelmiszerből is ki lehet mutatni az enzimet, így 4-5 órán belül eredmény mutatható Korreláció nem 100% az enterotoxin és temostabil DN-áz termelés között!

19. Biokémiai azonosítás 4. Enterotoxin kimutatása élelmiszerből: ELISA, RIA, de rutinszerűen sehol nem ezeket végzik, ugyanis az enterotoxin megoszlása egyenetlen, jól kötődhet az élelmiszer egyes anyagaihoz, így nem mindig lesz a próba pozitív, annak ellenére, hogy ott van a toxin

20. Szabványos vizsgálat Élelmiszerekből a szabvány nem a Staphylococcus aureus, hanem a koaguláz pozitív Staphylococcusok vizsgálatát írja elő. Szabványos vizsgálat esetén a gyanús telepekkel csak koaguláz próbát végzünk.

21. Pseudomonas aeruginosa Gr-, aerob, 1 csilló, általában a mikrobatest végén, 150-féle szénforrást tud hasznosítani (nyálkás-nyúlós telep, eltömi a fejőgépet) Legtöbb törzs trimetil-amin termelő → hársfavirág-illat Fluoreszcein → vízoldható (sárga), minden törzs termeli → táptalajba diffundál → zöld lesz körülötte → idővel oxidálódik, megbarnul → rozsdaszínű (latin: aerugo=rozsda) Piocianin → kloroformban oldódik (neutrális v. lúgos közegben kék), nem minden törzs termeli (régi név: Bacterium pyocyaneum)

22. Pseudomonas aeruginosa glükózt oxidatív úton bontja oxidáz + kataláz + nitrát→nitrogén-gázzá redukálja (!!) karbamidot, acetamidot bontja zselatint elfolyósítja triptofánból indolt NEM termel

23. Pseudomonas aeruginosa • Előfordulás: talaj, víz, gennyes folyamatok („kékgenny-betegség”) • fakultatív pathogén → állomány-szinten mastitis (1-2%) – fejőrendszerben túlélhet • 106/g felett ételmérgezést okoz • Ellenálló-képesség: • beszáradást, hőt nem bírja • antibiotikumoknak viszonylag ellenáll • kvaterner ammónium-sókkal szemben rezisztensek • egyes amfoter vegyületekben még szaporodnak is

24. Pseudomonas aeruginosa tenyésztése Szilárd: • Cetrimid-agar: gátlóanyag: N-cetyl-N,N,N-trimethyl- ammoniumbromide (cetrimid) 37oC, 24-48 óra, (növekedés 42 oC-on is) • Véres agar: ß-haemolysis, büdös • Z-agar: szintetikus (acetamid az egyetlen szénforrás) Telepmorfológia: 2-4 mm, kerek-ovális, sima, domború, erősen nyálkás, gyöngyház fényű, hársfavirág-illatú Folyékony: • Nitrofurantoinos leves: zavarosodás • Z-leves

25. Pseudomonas aeruginosa azonosítása • Oxidáz próba: pozitív • Nitrátredukció: komplett • Indol-próba: negatív • Kataláz-próba: pozitív • Piocianin-termelés: +kloroform → a kloroformos fázis kék • Karbamid-bontás: karbamid → ammónia (fenolvörös indikátor: sárga →lila) • Glükóz aerob oxidációja: szőlőcukros magas-agar tetején, hártyaszerűen nő, itt sárga, máshol piros marad

26. Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok • Gram-pozitiv, obligát anaerob, kataláz negativ, spórás baktériumok • Hőmérsékleti optimum 37 oC • Peritrich csillóval mozognak • Tojás-, vagy gömb alakú spórát képeznek, amely centrálisan, vagy terminálisan helyezkedik el. A spóra átmérője nagyobb, mint a sejté. • Előfordulásuk talajban, vízben, emlősök bélcsatornájában • Szulfit tartalmú táptalajban fekete, vagy sötétszürke telepet képeznek • Néhány közülük hemolizál (különböző típusú hemolizis)

27. Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok A Cl. botulinum és a Cl. perfringens élelmiszer mérgezést okoz, a többi romlást. A vizsgálat menete: • Hígítási sor készítése • A félfolyékony, szulfit agart (Takács-Narayan) tartalmazó csövek beoltása (minden hígításból 2 cső, egyik a vegetatív, másik a spórás alakok kimutatására) a táptalaj vas(III)citrátot és Na-szulfit-ot tartalmaz. • 80 oC, 20 perc hőkezelés, a vegetatív sejtek elpusztítására és a spórák aktiválására az egyik csőben

28. Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok • Tenyésztés 37 oC, 48 óra. A felszín alatt kb. 0,5 cm-re látható feketedés jelzi a lehetséges pozitivitást. • Minden fekete, vagy sötétszürke csőből át kell oltani tojássárga D-cikloszerin szulfit agarra. • A lemezeket anaerob körülmények között inkubáljuk 37 oC–on 24 órán át. A pozitiv telepek feketék, vagy sötétszürkék, 1-2 mm átmérőjűek, néha opálos udvarral (lecitináz aktivitás), vagy fénylő felszinnel (lipáz aktivitás)

29. Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok megerősítése 1. Gram-festés: +,pálcák, 8-12 μm 2. Metilén-kék,tusfestés (háttér fekete, Clostridiumkék,a tokszíntelen) 3. Kataláz teszt: negatív